王小紅,王軍青,王志君,潘小紅

子癇前期嚴(yán)重危害著孕產(chǎn)婦及圍產(chǎn)兒的健康,發(fā)病機(jī)理至今仍不明。其發(fā)病機(jī)制一直是產(chǎn)科研究的重要課題,母胎免疫耐受是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)之一,直接暴露于母體血竇的胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞表面的人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)G分子在母胎局部免疫調(diào)控機(jī)制中起著極為重要的作用。為了進(jìn)一步闡明 HLA-G在母胎免疫耐受中的作用機(jī)制,本文研究了正常與子癇前期患者胎盤(pán)組織中 HLA-G的表達(dá),旨在揭示 HLA-G表達(dá)與子癇前期的發(fā)病關(guān)系,并為臨床篩查、預(yù)防及治療子癇前期提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取 2008年 1月至 2009年 1月我院分娩的 24例子癇前期患者胎盤(pán)組織為觀察組,輕度子癇前期 12例,重度子癇前期 12例,孕婦平均年齡(29.5±2.8)歲,平均孕周(37.6±1.8)周,同期分娩的正常妊娠婦女 24例胎盤(pán)組織為對(duì)照組,平均年齡(27.3±3.2)歲,平均孕周(39.3±1.1)周。兩組行均衡性檢驗(yàn),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),子癇前期診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《婦產(chǎn)科學(xué)》[1]。

1.2 標(biāo)本采集 胎盤(pán)娩出后 5min內(nèi)采集近臍根部母體面胎盤(pán)組織(避開(kāi)鈣化區(qū)及出血點(diǎn))大小約1.0 cm×1.0 cm×0.3 cm的組織,約 100 mg,用生理鹽水漂洗去除血液,干紗布吸除水分,裝入冷凍管后迅速入液氮保存,次日置 -80℃冰箱備用。

1.3 方法

1.3.1 RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈技術(shù)) 按 Trizol(美國(guó) Invitrogen公司)說(shuō)明書(shū)提取胎盤(pán)組織中總的RNA,采用 SuperScriptTMOne-Step RT-PCRwith Platinum·Taq試劑盒(Invitrogen公司),紫外分光光度計(jì)測(cè)定 RNA濃度后,加入 5μg模版 mRNA進(jìn)行絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞 mRNA的逆轉(zhuǎn)錄和第一輪擴(kuò)增。其中,上游引物設(shè)計(jì)在外顯子 1,下游引物設(shè)計(jì)在外顯子 5和 6的連接處,擴(kuò)增 HLA-G mRNA。采用Platinum·Taq DNA Polymerase High Fidelity試劑盒(Invitrogen公司)進(jìn)行第二輪 PCR。

1.3.2 Western blot(免疫印跡技術(shù)) 應(yīng)用常規(guī)蛋白提純方法提取細(xì)胞總蛋白,分離蛋白質(zhì),經(jīng)電轉(zhuǎn)印將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到 polyvinylidene difluoride(PVDF)膜上,用 5%脫脂奶粉封閉。加入稀釋度為 1∶500羊抗小鼠和羊抗兔 IgG過(guò)夜,室溫孵育 1 h。洗滌后,PVDF膜用應(yīng)用 SuperSignal化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國(guó)Pierce公司)進(jìn)行化學(xué)增強(qiáng)發(fā)光,曝光于 Kodak X膠片 15 s,顯、定影,多次洗滌后,掃描結(jié)果,用 Leica圖象分析儀測(cè)定免疫印記條帶密度 A值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 全部數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)工作用 SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件完成,進(jìn)行單因素方差分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果用±s表示,P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HLA-G在胎盤(pán)組織中的基因表達(dá)結(jié)果 半定量分析采用數(shù)字圖像分析系統(tǒng),RT-PCR顯示采用本實(shí)驗(yàn)中所設(shè)計(jì)的引物,在子癇前期孕婦與正常妊娠胎盤(pán)組織中均可擴(kuò)增到一片段長(zhǎng)度為 450 bp長(zhǎng)度的擴(kuò)增片段,結(jié)果顯示 HLA-G在子癇前期孕婦胎盤(pán)與正常妊娠孕婦胎盤(pán)組織中均有表達(dá),輕度子癇前期：0.492±0.091,重度子癇前期：0.454±0.136,均明顯低于正常妊娠組：0.711±0.129(P＜0.01),輕、重度子癇前期之間比較差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。見(jiàn)圖 1。

2.2 HLA-G在胎盤(pán)組織中的蛋白表達(dá)結(jié)果 Western blot顯示HLA-G在子癇前期胎盤(pán)與正常妊娠胎盤(pán)組織中均有蛋白表達(dá),子癇前期患者胎盤(pán)組織中HLA-G蛋白印跡條帶灰度值,輕度子癇前期：0.487±0.086,重度子癇前期：0.431±0.056,均明顯低于正常妊娠組：0.612±0.103(P＜0.01),輕、重度子癇前期之間比較差異無(wú)顯著性(P＞0.05),見(jiàn)圖 2。

3 討 論

3.1 HLA-G與子癇前期的關(guān)系 胚胎是一種半同種異體移植物,妊娠成功有賴于胎兒-母體間的免疫平衡,而這種平衡一旦失調(diào),即可能引發(fā)排斥反應(yīng),導(dǎo)致病理妊娠,子癇前期一直被認(rèn)為是由于子宮胎盤(pán)灌注低下引起,可能與母體對(duì)半異體基因的胎兒發(fā)生異常的免疫應(yīng)答有關(guān)[2]。同時(shí),子癇前期患者在胎兒分娩后即自然好轉(zhuǎn)的規(guī)律也提示疾病的根源可能在于母胎間免疫應(yīng)答變化。有學(xué)者認(rèn)為人類白細(xì)胞抗原 G、E和 F很可能在妊娠母體接受半同種移植的胎兒中具有功能協(xié)同作用,甚至相互置換,三者中尤以 HLAG與妊娠密切相關(guān)[3]。另有學(xué)者認(rèn)為 HLA-G在調(diào)節(jié)母胎免疫耐受方面具有關(guān)鍵性作用[4-5]。子癇前期生理性血管重鑄存在顯著的障礙,滋養(yǎng)細(xì)胞侵蝕僅達(dá)子宮螺旋動(dòng)脈蛻膜段,其可能的原因是 HLA-G表達(dá)缺陷的滋養(yǎng)細(xì)胞易受母體免疫系統(tǒng)攻擊不能有效侵入母體螺旋動(dòng)脈完成血管重鑄過(guò)程。HLA-G分子屬于非經(jīng)典的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)I類分子,其編碼基因位于人類 6號(hào)染色體緊鄰編碼經(jīng)典人類白細(xì)胞抗原 A附近,具有有限的分子多態(tài)性、選擇性組織分布和調(diào)控母體免疫細(xì)胞的功能等特點(diǎn)。由于HLA-G分子的特性及功能,人們推測(cè)它可能與子癇前期的發(fā)病密切相關(guān)。Hara等[6]發(fā)現(xiàn)正常妊娠絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞(extravillous trophoblast,EVT)均表達(dá)HLA-G蛋白,而子癇前期滋養(yǎng)細(xì)胞 HLA-G的表達(dá)呈孤島狀減少或缺失。Goldman等[7]應(yīng)用原位雜交的方法檢測(cè) HLA-GmRNA在正常妊娠和子癇前期胎盤(pán)的表達(dá),發(fā)現(xiàn)正常妊娠 HLA-G mRNA在絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞的表達(dá)沿侵入途徑逐漸升高,而在子癇前期胎盤(pán)的表達(dá)極少,缺少上述表達(dá)升高模式。Yie等[8]研究應(yīng)用特異性酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定了正常和子癇前期患者胎盤(pán)組織及血液中 HLA-G蛋白的表達(dá),發(fā)現(xiàn)血液及胎盤(pán)組織中 HLA-G蛋白的表達(dá)與發(fā)病具有相關(guān)性。子癇前期患者蛻膜局部的免疫微循環(huán)環(huán)境存在著 Th1/Th2比率失衡,HLA-G在調(diào)節(jié) Th1/Th2細(xì)胞因子的平衡方面具有重要作用[9]。HLA-G介導(dǎo)的細(xì)胞因子失衡可能是子癇前期發(fā)病的重要因素[10]。以上研究表明 HLA-G可能與子癇前期的發(fā)病過(guò)程有著密切關(guān)系。但是還有研究對(duì)此提出了不同觀點(diǎn),他們應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法分析了正常胎盤(pán)組織與重度子癇前期患者胎盤(pán)組織中 HLA-G的表達(dá),發(fā)現(xiàn) HLA-G的減少不僅存在于子癇前期胎盤(pán)組織,正常胎盤(pán)細(xì)胞滋養(yǎng)層也存在 HLA-G減少的區(qū)域,從而提出 HLA-G生成降低并不是子癇前期發(fā)病的原因,而是由于滋養(yǎng)層細(xì)胞壞死減少所致[11-12]。對(duì)這些文獻(xiàn)分析發(fā)現(xiàn)兩種分歧的觀點(diǎn)主要是由于實(shí)驗(yàn)中標(biāo)本的采集方法及實(shí)驗(yàn)中的檢測(cè)方法造成的,因此,為了進(jìn)一步闡明 HLA-G分子與子癇前期的關(guān)系,本實(shí)驗(yàn)我們采用 RT-PCR法結(jié)合 Western blot技術(shù)較系統(tǒng)研究了HLA-G在子癇前期孕婦與正常妊娠孕婦胎盤(pán)組織中在基因與蛋白表達(dá)水平,更為精確地研究了HLA-G的表達(dá)量。

3.2 HLA-G在子癇前期患者胎盤(pán)中的表達(dá) Western blot免疫印跡方法是一種對(duì)蛋白表達(dá)進(jìn)行較精確定量的方法,本研究結(jié)果顯示 HLA-G在基因與蛋白水平上均有明顯降低,尤其在蛋白表達(dá)水平 HLA-G降低更為明顯,表明子癇前期胎盤(pán)組織 HLA-G表達(dá)水平降低確實(shí)與子癇前期發(fā)生有關(guān),輕重度子癇前期的表達(dá)水平無(wú)差異,故 HLA-G尚不能作為子癇前期病情嚴(yán)重程度的篩選指標(biāo)。HLA-G蛋白在子癇前期胎盤(pán)組織內(nèi)表達(dá)水平的降低達(dá)一定程度后可能不足以讓母體子宮內(nèi)的免疫細(xì)胞產(chǎn)生免疫耐受,致使母體子宮對(duì)胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生了免疫攻擊,一方面致使胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞不能向子宮脫膜深層浸潤(rùn),產(chǎn)生淺著床,導(dǎo)致胎盤(pán)供血不足,影響胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育,同時(shí)母-胎界面不斷的免疫炎癥反應(yīng)產(chǎn)生大量持續(xù)不斷的炎癥因子,導(dǎo)致母體全身廣泛的動(dòng)脈收縮與痙攣,造成母體動(dòng)脈血壓急劇升高,導(dǎo)致子癇前期的發(fā)生。文獻(xiàn)中產(chǎn)生的不同觀點(diǎn)可能與胎盤(pán)組織 HLA-G表達(dá)降低的程度有關(guān),因?yàn)橹挥薪档偷揭欢ǔ潭群?才能讓母體子宮不產(chǎn)生免疫耐受。至于 HLA-G對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞功能尤其是調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞對(duì)子宮蛻膜組織的黏附、浸潤(rùn)影響方面尚待深入、系統(tǒng)研究,HLA-G表達(dá)水平可能作為臨床篩查子癇前期的指標(biāo)。

[1]樂(lè) 杰.婦產(chǎn)科學(xué)[M].6版.北京：人民衛(wèi)生出版社,2004：105.

[2]Clements CS,Kjer-Nielsen L,Kostenko L,et al.Crystal structure of HLA-G：a nonclassical MHC class Imolecule expressed at the fetal-matemal interface[J].Proc Natl Acad Sci,2005,102(9)：3360-3365.

[3]HviidTV.Non-c lassical human leukocyte antigen(HLA)tissue types-from implantation to trasplantation[J].Ugeskr Laeger,2006,168(5)：461-466.

[4]Zhang L,Wang Y,Liao AH.Quantitative abnormalities of fetal trophoblast cells inmaternalcirculation in preec lampsia[J].Prenat Diagn,2008,28(12)：1160-1166.

[5]Iversen AC,Nyugen OT,Tommerdal LF,et al.The HLA-G 14 bp gene polymorphism and decidual HLA-G 14bp gene expression in pre-eclamptic and normal pregnancies[J].JReprod Immunol,2008,78(2)：158-165.

[6]Hara N,Fujii T,Yamashita T.A ltered expression of human leukocyte antigen G(HLA-G)on extravillous trophoblasts in preeclampsia：immunohistological demonstrationwith anti-HLA-G specific antibody“87G” and anti-cytokeratin antibody“CAM 5.2”[J].Am JReprod Immunol,1996,36(6)：349-358.

[7]Goldman-Wohl DS,Ariel I,Greenfield C,et al.Lack of human leukocyte antigen-G expression in extravillous trophoblasts is associated with pre-eclampsia[J].Mol Hum Reprod,2000,6(1)：88-95.

[8]Yie SM,Li LH,Li YM,et al.HLA-G protein concentrations in maternal serum and placental tissue are decreased in preec lampsia[J].Am JObstet Gynecol,2004,91(2)：525-529.

[9]Kanai T,Fujii T,Unno N,etal.Human leukocyte antigen-G-expressing cells differently modulate the release of cytokines from mononuc lear cells present in the decidua versus peripheral blood[J].Am JReprod Immunol,2001,45(2)：94-99.

[10]Tan CY,Ho JF,Chong YS,etal.Paternalcontribution ofHLA-G 0106 significantly increases risk for pre-ec lampsia in multigravid pregnancies[J].Mol Hum Reprod,2008,14(5)：317-324

[11]Sageshima N,IshitaniA,Omura M,et al.Necrotic feature of the trophoblasts lacking HLA-G expression in normal and pre-eclamptic placentas[J].Am JReprod Immunol,2003,49(3)：174-182.

[12]Datema G,Van Meir CA,Kanhai HH,et al.Pre-term birth and severe pre-eclampsia are not associated with altered expression of HLA on human trophoblasts[J].Am JReprod Immunol,2003,49(4)：193-201.