趙樹臣,李 佳,劉景輝,薛 琢,侯振中

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,黑龍江哈爾濱150030;2.廣東農(nóng)墾畜牧有限公司,廣東湛江524000)

奶牛子宮內(nèi)膜炎是奶牛繁殖障礙的主要原因之一,臨床治療中,利用溶菌酶水溶液子宮灌注已取得一定的療效。將溶菌酶制備成泡騰栓劑,子宮內(nèi)給藥,泡騰劑與體液作用產(chǎn)生的大量泡沫,能夠深入黏膜皺褶,將溶菌酶分散到細(xì)菌感染的可到之處,保持較長時間的充分接觸,最大限度發(fā)揮藥物作用,力求取得更好的治療效果。

1 儀器與藥品

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱,崩解時限儀,分析天平,恒溫水浴箱,栓劑模型,溶菌酶,檸檬酸,酒石酸,酒石酸氫鉀,碳酸氫鈉,十二烷基磺酸鈉,吐溫-20,吐溫-60,PEG-6000,PEG-400。

2 試驗(yàn)方法

泡騰栓劑采用熱熔法制備,考慮到溶菌酶反復(fù)凍融會喪失活性的生物學(xué)特點(diǎn)[1],先對泡騰栓進(jìn)行輔料篩選,確定配方后,再混入溶菌酶,制備含溶菌酶的泡騰栓劑。

2.1 栓劑基質(zhì)準(zhǔn)備 將檸檬酸置105℃干燥2 h,碳酸氫鈉、酒石酸等于105℃干燥 1 h,分別研細(xì),過80目篩備用。將PEG-6000加熱熔融,均勻混入碳酸氫鈉,冷卻后研細(xì),過80目篩備用[2]。

2.2 泡騰栓酸堿源篩選[3]以pH為優(yōu)化指標(biāo),考查酒石酸(因素A)、酒石酸氫鉀(因素 B)、PEG-6000+碳酸氫鈉栓劑(因素C)、檸檬酸(因素D)用量,考察因素及水平見表1。

表1 酸堿源用量水平

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 準(zhǔn)確稱取基質(zhì)重量,按表3進(jìn)行試驗(yàn),以pH為栓劑評價因素[4]。

2.2.2 pH測定 取1粒栓劑置于50 mL燒杯中,加水5 mL,于水浴鍋40℃水浴,完全溶解(熔融)后,用精密pH試紙測定溶液pH值。

2.3 發(fā)泡劑的篩選 為了改善泡騰栓的發(fā)泡功能,延長泡沫持續(xù)時間,添加表面活性劑,也利于增加主藥溶出度。考查吐溫-20(因素A),吐溫-60(因素B),十二烷基磺酸鈉(因素C)的用量,以起泡時間、泡沫量、持續(xù)時間等為優(yōu)化指標(biāo)?？疾煲蛩丶八揭姳?。

表2 活性劑水平

2.3.1 栓劑評價[4]

2.3.2 泡沫量、泡沫持續(xù)時間的測定 在試管中加入1 mL水,于水浴鍋中40℃水浴5 min后加入1枚栓劑,觀察并記錄泡沫量、泡沫持續(xù)時間。

2.4 溶菌酶泡騰栓物理性狀檢查[4]

2.4.1 外觀 檢測外形是否均勻,表面是否光滑,有無分層或主藥沉積在一端的現(xiàn)象,是否有一定的硬度。在保存時是否酸敗變質(zhì)或變形。

2.4.2 重量差異 按中國藥典附錄Ⅰ,栓劑重量差異檢查法,取本品10粒,求得平均粒重后,再精密稱定各粒的重量,于平均粒重相比較,超出重量差異限度(±7.5%)的不多于1粒,并不得超出限度的1倍。

2.4.3 融變時限 分別取泡騰栓9粒,分3組在室溫放置1 h后,放入崩解時限儀進(jìn)行測定。

2.4.4 變形溫度測定[5]將1粒栓劑直立于100 mL燒杯中,由上部施以300 g的重力,采用液體石蠟為傳熱介質(zhì)水浴,以0.5℃/min～0.7℃/min的速度升溫,栓劑被完全壓扁時的溫度即為變形溫度。

2.4.5 pH測定 取1粒栓劑置于50 mL燒杯中,加水5 mL,于水浴鍋40℃水浴,完全溶解(熔融)后,用精密pH試紙測定溶液pH。

2.4.6 發(fā)泡時間、泡沫量、泡沫持續(xù)時間的測定[5]

在試管中加入1 mL水,于水浴鍋中40℃水浴5 min后加入1枚栓劑,觀察并記錄泡沫量、泡沫持續(xù)時間。

3 結(jié)果

3.1 泡騰栓酸堿源篩選 結(jié)果見表3。

表3 酸堿源正交設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

由R值得出,酸堿源各因素對栓劑pH的影響主次為 C＞D＞A＞B,故酸堿水平最優(yōu)方案為A3B2C2D3。

3.2 發(fā)泡劑的篩選 結(jié)果見表4。

由R值看出,發(fā)泡劑各因素的影響主次為B＞A＞C,綜合考慮起泡時間,泡沫細(xì)密程度及評定標(biāo)準(zhǔn)的主次,因素A和C分別取A3和C1,故最優(yōu)方案為A3B3C1。

3.3 泡騰栓輔料最優(yōu)處方 綜合各因素,泡騰栓的最優(yōu)處方為:PEG-400 1.2 g,PEG-6000 0.5 g,酒石酸0.08 g,酒石酸氫鉀 0.15 g,碳酸氫鈉0.15 g,檸檬酸 0.12 g,吐溫-20 0.02 g,吐溫-60 0.02 g,十二烷基磺酸鈉0.005 g。以此處方制備溶菌酶泡騰栓。3.4 溶菌酶泡騰栓物理性狀檢測結(jié)果

3.4.1 外觀 乳白色栓劑,外形均勻一致,表面光滑,色澤均勻,無裂縫,不起霜,將栓劑縱向、橫向切開,用放大鏡(規(guī)格 5×80)觀察,基質(zhì)分散均勻,無分層附聚現(xiàn)象,在體溫下能溶化或軟化,并且有一定的硬度。保存時不酸敗變質(zhì)、變形。

表4 表面活性劑的正交設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

3.4.2 重量差異 結(jié)果見表5。

表5 泡騰栓的重量差異

結(jié)果表明,栓劑的重量限度符合中國藥典(2000版)規(guī)定,說明泡騰栓重量差異限度合格。

3.4.3 融變時限、變形溫度、pH測定值結(jié)果 見表6。

結(jié)果表明,泡騰栓劑的融變時限13 min,符合藥典規(guī)定。變形溫度為38℃,與體溫接近,能夠在體溫及子宮內(nèi)液體的作用下熔融、崩解。pH呈弱堿性,減少對機(jī)體的刺激,同時,反應(yīng)產(chǎn)生的弱堿性環(huán)境能夠提高溶菌酶的生物活性,更好的發(fā)揮藥效。

表6 栓劑融變時限、變形溫度、pH測定值

3.4.4 發(fā)泡時間、發(fā)泡量和泡沫持續(xù)時間的測定見表7。子宮內(nèi)體液較少的內(nèi)環(huán)境,能夠增加泡沫的持續(xù)時間,延長溶菌酶與子宮內(nèi)膜的作用時間,利于殺滅致病細(xì)菌。

表7 發(fā)泡時間、發(fā)泡量和泡沫持續(xù)時間的測定結(jié)果

4 討論

4.1 溶菌酶臨床應(yīng)用的研究背景 奶牛子宮內(nèi)膜炎是造成奶牛不孕的主要病因之一,而臨床應(yīng)用抗生素治療會造成耐藥菌株不斷出現(xiàn)和奶中的抗生素殘留,危害極大。溶菌酶(lysozyme),作為目前比較新型的酶類抗菌藥物,以其廣譜高效的殺菌、無殘留、無污染的特性備受關(guān)注[6]。研究表明,使用溶菌酶水溶液進(jìn)行子宮內(nèi)灌注,對治療奶牛子宮內(nèi)膜炎效果明顯。同時,溶菌酶熱穩(wěn)定性很強(qiáng),在較寬的溫度和pH范圍內(nèi)均有活性[7]。Gorini等發(fā)現(xiàn)溶菌酶在酸性時穩(wěn)定,在堿性時不穩(wěn)定,Matsuoka等報(bào)道pH 4.5(100℃、3 min)、pH 5.29(100℃,30 min)的加熱溶菌酶是穩(wěn)定的,這些特性為溶菌酶泡騰栓的制備提供了有力的保證。

4.2 溶菌酶泡騰栓制備工藝的優(yōu)點(diǎn) 傳統(tǒng)的泡騰栓制備方法是直接將酸堿源混入融化基質(zhì)中,攪拌均勻后灌裝制備,制備的泡騰栓劑普遍存在反應(yīng)較慢,起泡時間較長的問題。本試驗(yàn)制備方法參考了大量資料,采用了PEG-6000包合碳酸氫鈉法[8],有效地隔離酸源與二氧化碳源(堿源),使泡騰劑發(fā)揮最佳功效,大大提高了反應(yīng)速度,縮短起泡時間,并且提供的酸性環(huán)境,有利于溶菌酶的生物學(xué)活性。

4.3 溶菌酶泡騰栓臨床應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn) 臨床上,使用溶菌酶泡騰栓治療奶牛子宮內(nèi)膜炎時,溶菌酶泡騰栓與子宮分泌物接觸后,迅速崩解,產(chǎn)生的泡沫能夠深入子宮黏膜皺褶部位,刺激性小,大量的泡沫把溶菌酶迅速廣泛地分布至細(xì)菌可到之處,同時子宮內(nèi)液體較少的內(nèi)環(huán)境,增加了泡沫的持續(xù)時間。與溶菌酶水溶液進(jìn)行子宮內(nèi)灌注的治療方法相比較,溶菌酶泡騰栓劑的作用時間長,不易流失,同樣劑量藥效更顯著,同時使用方便,操作簡單,值得在臨床中大力推廣應(yīng)用。

[1]船津勝,鶴大典.溶菌酶[M].李光福,譯.濟(jì)南:山東科學(xué)技術(shù)出版社,1982.

[2]周文孝.聚乙二醇在劑型優(yōu)化中的應(yīng)用[J].中國藥學(xué)雜志,1995,30(12):713.

[3]羅明生,劉天惠.藥劑輔料大全[M].成都:四川科學(xué)技術(shù)出版社,1993:23.

[4]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].2000版二部.

[5]鄒力家,張秀珍,張淑萍,等.滴炎凈泡騰栓的研制[J].山東醫(yī)藥工業(yè),1987(3):15.

[6]朱奇,陳彥.溶菌酶及其應(yīng)用[J].生物學(xué)報(bào),1998,33(10):9-10.

[7]方元超,梅叢笑,尹寧.溶菌酶及其應(yīng)用前景[J].中國食品添加劑,1999(4):39-43.

[8]俞加林,劉莉,孫湘莉,等.清開靈泡騰片制備工藝的研究[J].中成藥,2001(8):23.