劉秀萍,唐雨順,寇 敘,劉永華,唐 峰

(遼寧醫(yī)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院,遼寧錦州121001)

人們隨著生活水平的提高,對(duì)牛奶質(zhì)量的要求越來(lái)越高。牛奶被稱為“白色血液”,是理想的天然食品,其中的乳蛋白含有人體幾乎所有的必需氨基酸具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1]。但是近年來(lái),國(guó)內(nèi)外不斷曝光食品安全問(wèn)題,使牛奶質(zhì)量問(wèn)題成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。在奶牛飼養(yǎng)過(guò)程中,用于預(yù)防和治療作用的抗生素藥物也嚴(yán)重的影響著牛奶的衛(wèi)生質(zhì)量,同時(shí)在牛奶加工過(guò)程中為了延長(zhǎng)牛奶的保存時(shí)間也可能人為添加抗生素。當(dāng)人類經(jīng)常食用含有抗生素殘留物的乳品,等于長(zhǎng)期低劑量吸收相應(yīng)的抗生素,這樣就會(huì)致使病菌的耐藥性上升,亦可導(dǎo)致體內(nèi)正常菌群失去平衡[2]。本文對(duì)錦州市市售牛奶中抗生素殘留情況做了調(diào)查,調(diào)查包括導(dǎo)致市售牛奶中抗生素殘留的主要疾病因素和用藥率情況。同時(shí),還對(duì)錦州市各大、小超市的袋裝奶190份和錦州市郊的散養(yǎng)奶牛的新鮮牛奶70份進(jìn)行抗生素殘留檢測(cè),以了解市售牛奶中抗生素殘留的狀況。

1 資料與方法

1.1 資料的來(lái)源 2009年1～3月期間,對(duì)遼寧醫(yī)學(xué)院畜牧農(nóng)場(chǎng)、北山種畜場(chǎng)、錦州開(kāi)發(fā)區(qū)牧場(chǎng)、鐵路養(yǎng)殖場(chǎng)、市郊(唐莊子、宋家溝、流水等)牧場(chǎng)的奶牛數(shù)量、常見(jiàn)病、發(fā)病數(shù)、發(fā)病率、用藥等情況進(jìn)行詳細(xì)調(diào)查。并對(duì)錦州市郊奶源戶的生鮮牛奶及各大、小型超市市售成型包裝純牛奶隨機(jī)抽樣做抗生素殘留的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

1.2 檢測(cè)方法 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的現(xiàn)有儀器設(shè)備情況我們采用了兩種方法即GB-TTC和CM T-快速檢測(cè)試劑盒的方法。

1.2.1 GB-TTC方法[3]菌種:嗜熱乳酸鏈球菌(由上海天呈科技有限公司提供);試劑:2,3,5-氯化三苯四氮唑(由上海如吉生物技術(shù)有限公司提供);牛奶:錦州市各超市;錦州市周邊的養(yǎng)殖戶;注射用青霉素G鉀:160IU,由武漢遠(yuǎn)程科技發(fā)展有限公司提供;注射用硫酸慶大霉素:2 mL,8萬(wàn)單位,由山東益康藥業(yè)有限公司提供。

1.2.1.1 試驗(yàn)前準(zhǔn)備 從錦州各大、小超市分別購(gòu)買不同批次、不同廠家的袋奶;從錦州市郊采集剛擠出的鮮奶。取健康無(wú)病牛剛擠出的鮮牛奶,于2 000 r/min離心15 min,移去上層脂肪。將試管、吸管、脫脂乳等置于113℃滅菌20 min;將菌種移種脫脂乳,經(jīng)(36±1)℃培養(yǎng) 15 h后,以滅菌脫脂乳1∶1稀釋待用。

1.2.1.2 TTC試劑制備 稱取1 g TTC溶于5 mL滅菌蒸餾水中,裝入褐色瓶?jī)?nèi),置于7℃冰箱保存。臨用時(shí)再用滅菌蒸餾水稀釋至5倍。如遇溶液變?yōu)楹稚驕\褐色,則不能再用。

1.2.1.3 樣品檢測(cè) 取檢樣9 mL,置于16 mm×160 mm試管內(nèi),80℃水浴加熱5 min后冷卻至37℃以下,加菌液1 mL,(36±1)℃水浴培養(yǎng)2 h,加 TTC 0.3 mL,(36±1)℃水浴培養(yǎng)30 min,觀察如為陽(yáng)性,再于水浴中培養(yǎng)30 min作第2次觀察。每份檢樣作兩份,另外再作陰性和陽(yáng)性對(duì)照各1份。陽(yáng)性對(duì)照管用無(wú)抗生素的乳8 mL加抗生素及菌液和TTC,陰性對(duì)照管用無(wú)抗生素乳9 mL加菌液和TTC。

1.2.1.4 判定標(biāo)準(zhǔn) 乳中有抗生素存在,則檢樣中雖加入菌液培養(yǎng)物,但因細(xì)菌的繁殖受到抑制,因此指示劑TTC不還原,不顯色。相反,如果沒(méi)有抗生素存在,則加入菌液即行繁殖,TTC被還原而顯紅色。即檢樣呈乳汁原色時(shí)為陽(yáng)性,顯紅色時(shí)為陰性。顯色狀態(tài)判斷標(biāo)準(zhǔn):未顯色者為陽(yáng)性;微紅色者為可疑;桃紅色或紅色為陰性。

1.2.2 CMT方法[4]

1.2.2.1 材料 干燥培養(yǎng)箱、CMT試劑盒、移液槍等。

1.2.2.2 操作方法 (1)每塊微孔板共有96個(gè)檢測(cè)孔,可被分成6小塊(每塊含16個(gè)檢測(cè)孔)。小心掰開(kāi)所需數(shù)量的檢測(cè)孔(用剪刀剪開(kāi)封口鋁箔薄膜)。注意不要損壞剩余檢測(cè)孔上的封口鋁箔薄膜(封口鋁箔薄膜的損壞會(huì)導(dǎo)致孔內(nèi)培養(yǎng)基的脫水)。(2)撕開(kāi)待用檢測(cè)板上的封口鋁箔薄膜。(3)用加樣器向每個(gè)檢測(cè)孔加入100 μ L待檢樣本。使用一次性的槍頭,避免相鄰檢測(cè)孔之間由于樣品潑澗、溢出所導(dǎo)致的交叉污染。(4)使用試劑盒提供的封口膜將檢測(cè)孔口封住。(5)將檢測(cè)板/小塊放置在預(yù)熱的(64±0.5)℃水浴鍋(或其他的溫浴裝置)中溫浴3 h。盡量保證溫浴溫度的恒定,溫度的波動(dòng)會(huì)導(dǎo)致溫浴時(shí)間的延長(zhǎng)。

1.2.2.3 判定標(biāo)準(zhǔn) 在(64±0.5)℃條件下溫浴3 h后,從檢測(cè)孔底端和側(cè)面判讀顏色變化。可根據(jù)試劑盒提供的顏色對(duì)照卡來(lái)判斷檢測(cè)結(jié)果。(1)陰性:黃色表明該樣品沒(méi)有抗生素殘留或抗生素殘留的含量低于試劑盒的檢測(cè)限。(2)陽(yáng)性:紫色表明該樣品中含有抗生素殘留,且濃度高于試劑盒的檢測(cè)限。(3)部分陽(yáng)性:如果顏色介于黃色和紫色之間,則表明該樣品可能不含有抗生素殘留或抗生素殘留的含量低于試劑盒的檢測(cè)限。參照顏色對(duì)照卡來(lái)判斷結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 調(diào)查結(jié)果

2.1.1 導(dǎo)致抗生素殘留的主要疾病因素 對(duì)錦州奶源戶的奶牛的常發(fā)病及其發(fā)病率做了詳細(xì)的調(diào)查,結(jié)果顯示,牛的產(chǎn)后疾病主要有:胎衣不下,乳房炎,子宮內(nèi)膜炎,產(chǎn)后癱瘓等。具體內(nèi)容見(jiàn)表1。

表1 錦州地區(qū)奶牛常見(jiàn)疾病調(diào)查

2.1.2 用藥情況調(diào)查 錦州地區(qū)奶牛產(chǎn)后疾病發(fā)生后,當(dāng)?shù)孬F醫(yī)工作者常用抗生素的主要成分及給藥途徑調(diào)查顯示:頭孢噻呋鈉:靜脈注射;青霉素:靜脈注射或肌肉注射,清洗,灌注;鏈霉素:靜脈注射或肌肉注射,清洗,灌注;克林霉素:肌肉注射;硫酸慶大霉素:肌肉注射;硫酸小諾霉素:肌肉注射。

2.2 檢測(cè)結(jié)果 2009年4～6月份歷經(jīng)3個(gè)月的時(shí)間,共隨機(jī)抽檢市售成型包裝純牛奶190份及錦州奶源戶生鮮牛奶70份,共260份。分別用國(guó)標(biāo)(TTC)法和CMT法進(jìn)行檢測(cè)并對(duì)兩種方法加以比較。TTC法檢測(cè)結(jié)果為奶源戶生鮮牛奶陽(yáng)性率17.14%,市售成型包裝純牛奶陽(yáng)性率15.71%。CMT法檢測(cè)結(jié)果為奶源戶生鮮牛奶陽(yáng)性率20.00%,市售成型包裝純牛奶陽(yáng)性率21.14%。見(jiàn)表2。

表2 兩種方法檢測(cè)牛奶中抗生素殘留結(jié)果

3 討論

3.1 牛奶中抗生素殘留的原因 引起牛奶中抗生素殘留的因素有奶牛疾病治療、飼料添加、牛奶防腐等,因此建議養(yǎng)殖戶加強(qiáng)飼養(yǎng)管理,減少奶牛產(chǎn)后疾病的發(fā)生,降低產(chǎn)后疾病的發(fā)病率,同時(shí)要嚴(yán)格遵守休藥期規(guī)定,不要為了一時(shí)的利益,損害人民的身體健康。3.2 國(guó)標(biāo)TTC方法和CMT試劑盒的比較分析

T TC方法的培養(yǎng)溫度是(36±1)℃,菌種為嗜熱乳酸鏈球菌,該法簡(jiǎn)便、快速,無(wú)需特殊設(shè)備,3～4 h可見(jiàn)報(bào)告,很適合牧場(chǎng)、乳品廠及食品衛(wèi)生檢測(cè)部門采用;CMT方法的培養(yǎng)基溫度是(64±1)℃,菌種嗜熱脂肪芽孢桿菌,操作簡(jiǎn)單,要求取量精確,但費(fèi)用較昂貴。

3.3 試驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)注意的問(wèn)題 菌種和試劑的保存要符合條件,否則會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果,嚴(yán)重的導(dǎo)致沒(méi)有結(jié)果。尤其是CM T試劑盒的操作,應(yīng)該小心,防止交叉污染。試驗(yàn)結(jié)果的讀取要及時(shí),這樣結(jié)果準(zhǔn)確。3.4 牛奶中抗生素殘留是涉及人類健康的公共衛(wèi)生問(wèn)題 應(yīng)加強(qiáng)生產(chǎn)者的主體意識(shí)和管理者的執(zhí)法教育,并努力研究發(fā)展一些簡(jiǎn)單、快速和便攜化的篩選多殘留的分析技術(shù),以提高分析效率、降低成本,保證消費(fèi)者的健康。

[1]GB/T 4789.27-1993.食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn):鮮乳中抗生素殘留量檢驗(yàn)[S].

[2]曾偉.奶牛乳房炎綜合防治[J].四川畜牧獸醫(yī),2009,36(2):47-49.

[3]侯亞莉,朱奎,丁雙陽(yáng).牛奶中抗生素殘留檢測(cè)技術(shù)[J].中國(guó)乳業(yè),2008,6:56-59.

[4]吳杰.牛奶中抗生素殘留檢測(cè)方法的研究[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2005,12(32):1767-1768.

[5]沈永聰,李守軍,楊林.牛奶中抗生素殘留檢測(cè)技術(shù)進(jìn)展[J].食品科學(xué),2006,5:87-89.

[6]吳國(guó)娟,沈江,張中文,等.市售消毒純牛奶中抗菌藥物殘留的檢測(cè)[J].北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào),2002,117(2):335-337.

[7]余奇飛,陳翠蓮,孫莉娜,等.牛奶中抗生素殘留檢測(cè)方法的研究進(jìn)展[J].農(nóng)產(chǎn)品加工學(xué)報(bào),2005,11(11):72-75.

[8]章銀良,伍季,鮑彤華.牛奶中抗生素殘留檢測(cè)方法的研究現(xiàn)狀[J].鄭州輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào),2006,11(21):21-25.