張春紅,蔣智勇,孫麗華,宋長緒

(廣東省農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)研究所廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實驗室,廣東廣州510640)

PK-15是豬腎傳代細胞系,其父母代源自1955年美國Stice提供的成年豬腎細胞PK-2a,后被美國ATCC收藏(收藏號為 ATCC-CCL33)[1]。PK-15細胞現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于豬瘟病毒、豬偽狂犬病病毒、豬細小病毒等的分離、體外增殖以及多種獸用疫苗的生產(chǎn)。目前影響PK-15細胞使用的最大問題是豬圓環(huán)病毒(PCV)的污染。PCV屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬,是一種環(huán)狀的單股DNA病毒,基因組大小為1 767～1 768 bp,有 PCV1和PCV2兩種基因型或血清型[2]。PCV2是從患斷奶多系統(tǒng)衰竭綜合征的仔豬群中分離到[3],因其對豬有一定的致病性,受到很多養(yǎng)豬場獸醫(yī)和研究人員的重視。PCV1是1974年由德國 Tischer等從PK-15細胞中作為一種類似病毒顆粒污染物分離出來,對豬沒有致病性[4]。通過對PK-15細胞受PCV1污染的溯源調(diào)查發(fā)現(xiàn),在其被ATCC收藏后不久就可以檢測出PCV1的污染。然而污染的來源目前還不清楚,很可能在最初的豬腎細胞PK-2a中就出現(xiàn),或者可能是當初由污染的血清或其他細胞培養(yǎng)添加物(如豬源胰蛋白酶)攜帶入PK-15細胞[5]。目前,國內(nèi)外使用的PK-15細胞都源自ATCC-CCL33,若用它培養(yǎng)病毒生產(chǎn)疫苗,很可能會使疫苗受到PCV1的污染,在西班牙商品化的豬偽狂犬病活疫苗中就發(fā)生過這種情況[6]。雖然PCV1無致病性,但作為一種潛在污染物還是不可接受的。另外,由于PCV1和PCV2接種PK-15細胞后,都能持續(xù)感染且不表現(xiàn)細胞病變(CPE),在培養(yǎng)這兩種病毒時會時常發(fā)生互相污染的情況;同時因為 PCV1和PCV2的ORF1核酸同源性可達86%,而且兩者ORF1所編碼的蛋白抗原存在交叉,這對研制PCV2的診斷試劑、疫苗和抗體檢測等帶來不利影響[7]。綜上所述,當前迫切需要一種無PCV1污染的PK-15細胞。本文介紹了一種通過有限稀釋克隆來清除PK-15細胞中PCV1污染的方法,并結(jié)合半套式PCR篩選出2株P(guān)CV1陰性且能穩(wěn)定傳代的PK-15細胞,為今后PCV的分離鑒定和疫苗研制等提供了一種更好的細胞株。

1 材料與方法

1.1 試劑 MEM培養(yǎng)基和胰蛋白酶為GIBCO公司產(chǎn)品;胎牛血清購自天津灝洋生物制品公司;廣譜型基因組DNA純化試劑盒、DL-2 000 DNA Marker、Premix Taq酶、pMD18-T載體購自 TaKaRa公司。

1.2 細胞株 含PCV1的PK-15細胞,由本實驗室保存。

1.3 引物 根據(jù)已發(fā)表的的 PCV1中國分離株BJ-1基因組序列(GenBank號:FJ475129.2),設(shè)計3條引物。引物 P1(5′-T TCT TTAT TCTGCTGGTCGG-3′)位于 ORF1的303～ 322 bp處,引物 P2(5′-CAACTGCTGTCCCAGCTGTAG-3′)位 于ORF1的 831～ 851 bp處,引物 P3(5′-GGTACCCGAAGGCCGAT TTG-3′)位于 ORF1 的 916 ～935 bp處。引物P1和P2擴增的片段長1 251 bp,引物P1和P3擴增的片段長1 166 bp。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 含PCV1的PK-15細胞的有限稀釋培養(yǎng) 用MEM生長液(含 5%胎牛血清)復蘇含 PCV1的PK-15細胞,待細胞長成單層后,用0.25%胰蛋白酶消化后制成單細胞懸液并計數(shù)活細胞。然后用MEM生長液稀釋至每毫升含10個細胞,分種于96孔培養(yǎng)板,每孔0.1 mL,置含5%CO2的培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng),待細胞克隆長至孔底面積的 1/3～1/2時,刮取孔中少量細胞,用于提取細胞DNA。

1.5 細胞總基因組的提取 參照“廣譜型基因組DNA純化試劑盒”說明書提取細胞DNA。

1.6 半套式PCR 采用25 μ L PCR反應(yīng)體系。第一步PCR擴增使用P1和P2引物,條件設(shè)置為:94℃預(yù)變性5 min后,按94℃變性1 min,65℃退火1 min,72℃延伸 1 min,共 35個循環(huán),最后 72℃延伸7 min。第二步PCR擴增使用P1和P3引物,取第一次PCR產(chǎn)物1 μ L作為模板,條件設(shè)置同第一步,但退火溫度為56℃。對PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,將陽性條帶回收純化后,連接pMD18-T載體,送上海博亞公司進行測序,所得序列與GenBank中的序列進行比較。

1.7 PCV1陰性的PK-15細胞傳代培養(yǎng) 將1.6檢測為PCV1陰性的PK-15細胞擴大培養(yǎng),然后按1.4的有限稀釋法繼續(xù)克隆篩選,如此連續(xù)克隆2～3次,至克隆孔100%陰性為止。篩選出的PCV1陰性的PK-15細胞株,一部分液氮保存,一部分繼續(xù)傳代,并每隔2～3 d傳代1次,連續(xù)傳代 30次,每代抽取少量細胞按1.5和1.6方法作PCR檢測,以測定其穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 半套式PCR結(jié)果 復蘇的含PCV1的PK-15細胞經(jīng)第一次有限稀釋法克隆,得到 70個克隆,經(jīng)半套式PCR的檢測,其中45個克隆為PCV1陰性,25個克隆為PCV1陽性。陽性克隆的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,在1 166 bp處有一條特異性的條帶,陰性克隆沒有任何條帶(圖1)。該條帶經(jīng)測序后與孫麗華等報道的從PK-15細胞中擴增的PCV1病毒的ORF1序列(GenBank號:EF493843.1)完全相同,說明PK-15細胞確實受到PCV1的污染。

圖1 半嵌套式PCR結(jié)果

2.2 PCV1陰性PK-15細胞的傳代培養(yǎng) 將第一次PCR檢測為PCV1陰性的45個克隆繼續(xù)培養(yǎng)2～3 d再進行第二次PCR檢測,獲得9個PCV1陰性克隆孔。將這9個PCV1陰性的細胞克隆擴大培養(yǎng),再繼續(xù)用有限稀釋法克隆,最終獲得2株P(guān)CV1陰性的PK-15細胞株(PK-15/B2和PK-15/B5),這2株細胞分別再用有限稀釋法克隆2次,獲得的克隆孔全為PCV1陰性。另將這2株細胞分別傳代培養(yǎng),直至30代,每代細胞的檢測結(jié)果也均為PCV1陰性。

3 討論

3.1 PCV1可長期持續(xù)污染PK-15細胞,但不表現(xiàn)CPE。在有 PCV1污染的 PK-15細胞中,因為PCV1的增殖速度慢,PK-15細胞的生長速度快,在快速生長的細胞中會有少數(shù)細胞未被PCV1感染,因此可以通過多種方法進行單細胞的篩選,如軟瓊脂法、顯微操作法和有限稀釋法等。本研究選用相對簡單的有限稀釋法對PK-15細胞進行篩選。

3.2 半套式PCR是利用第一次PCR擴增產(chǎn)物作為第二次PCR擴增的模板,而且因為第二次PCR反應(yīng)中的一個引物縮進,使靶DNA序列得到有效的選擇性擴增,大大提高了擴增的靈敏性和特異性。本研究中在第一次克隆得到的70個克隆孔中,第一次檢測有45個克隆孔為陰性,2～3 d后進行第二次PCR檢測,只有9個克隆孔為陰性。這種在陰性克隆中又出現(xiàn)PCV1陽性的原因,可能與半套式PCR檢測方法的極限度有關(guān)。當PK-15細胞中感染PCV1的細胞占極少量時,半套式PCR方法不能檢測到病毒;細胞擴大培養(yǎng)后,病毒得以繁殖,數(shù)量超過檢測下限,又能被檢測出來。所以,需要經(jīng)過數(shù)次的克隆和檢測篩選,才可以獲得穩(wěn)定的不含PCV1的PK-15細胞。本研究獲得的2株P(guān)CV1陰性的PK-15細胞,經(jīng)傳代30代次后仍檢測不到PCV1,說明這兩個細胞株的遺傳性質(zhì)穩(wěn)定,它們的獲得為臨床分離和鑒定PCV、PCV的抗體檢測及PCV的疫苗研制等提供了良好的保障。

[1]Hay R.AT CC catalogue of cell lines and hybridomas[M].USA:ATCC,1994.

[2]殷震,劉景華.動物病毒學[M].2版.北京:科學出版社,1997.

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[4]Tischer I,Rasch R,Tochtermann G.Characterization of a papovavirus and picornavirus-like particles in permanent pig kidney cell lines[J].Zentralbl Bakteriol,1974,226:153-167.

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