賈立軍,張守發(fā)

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動物醫(yī)學(xué)系,吉林龍井133400)

新孢子蟲病(Neosporiasis)是由犬新孢子蟲(Neospra caninum)寄生于犬、牛、羊等多種哺乳動物細(xì)胞內(nèi)而引起的一種原蟲病[1-2]。該病主要引起母畜的流產(chǎn)、死胎或新生胎兒的運(yùn)動障礙和神經(jīng)系統(tǒng)等癥狀,該病對牛的危害尤為嚴(yán)重,可垂直傳播,帶蟲母?？蓪⑾x體直接傳給新生犢牛,已證實(shí)該病是造成養(yǎng)牛業(yè)嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失的一個(gè)重要原因[3]。雖然國內(nèi)建立了多種血清學(xué)診斷方法,但血清學(xué)診斷用抗原均為重組蛋白,其敏感性、特異性將會受到不同程度的影響[4-5]。因此,針對上述問題,本試驗(yàn)對新孢子蟲蟲體抗原進(jìn)行了分析,并應(yīng)用特異性蟲體抗原建立特異、敏感、穩(wěn)定的Dot-ELISA血清學(xué)診斷方法,旨在為今后新孢子蟲病的診斷和預(yù)防等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 新孢子蟲Nc-1株、ICT試紙條均由日本帶廣畜產(chǎn)大學(xué)原蟲病研究中心惠贈;RPMI-1640培養(yǎng)基購自北京華美轉(zhuǎn)導(dǎo)科技有限公司;犢牛血清購自北京元亨圣馬生物工程公司;非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero)由延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存;牛血清樣本采自延邊地區(qū)某養(yǎng)牛場;其他材料由延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 新孢子蟲的體外培養(yǎng)及分離 將凍存復(fù)蘇的新孢子蟲Nc-1株接種到已長成單層的Vero細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,在37℃,5%CO2濃度,飽和濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng),隔天換液,每天用倒置顯微鏡觀察支撐細(xì)胞和新孢子蟲的形態(tài)。按常規(guī)寄生蟲培養(yǎng)方法傳代培養(yǎng)3代,然后應(yīng)用27號針頭分離在Vero細(xì)胞上培養(yǎng)的新孢子蟲,收集蟲體-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 新孢子蟲抗原的制備及特異性分析 將最終收集的新孢子蟲置-20℃冰箱中反復(fù)凍融、超聲波粉碎處理后,以2 000 r/min離心10 min,收集上清液,即為新孢子蟲抗原。將收集的抗原于透析袋濃縮后,用UV-754型紫外分光光度計(jì)測定蛋白濃度。采用SDS-PAGE及Western blot對新孢子蟲抗原進(jìn)行分析,找出具有較好反應(yīng)原性的抗原。

1.4 Dot-ELISA程序和最佳反應(yīng)條件的確定

1.4.1 最適抗原包被濃度的確定 在硝酸纖維素膜光面上劃4×4 mm的方格,切成10×4個(gè)格的大膜片,于蒸餾水中浸泡 5 min后,取出置室溫或37℃干燥。用碳酸鹽緩沖液(0.1 mol/L,pH 9.6)稀釋抗原 ,按 5 μ g/mL 、10 μ g/mL 、20 μ g/mL 、40 μ g/mL 、80 μ g/mL 進(jìn)行稀 釋,分別取 1 μ L 點(diǎn)于每一個(gè)小方格的正中央,置室溫或37℃干燥,將干燥好的抗原膜片浸于封閉液中,37℃封閉30 min。取出干燥后,將抗原膜片切成小片,放入微量反應(yīng)板的小孔中,點(diǎn)樣面朝上。將陽性、陰性血清1∶100稀釋后每孔加 50 μ L,37℃感作30 min。用 PBS(0.1 mol/L,pH 7.2)洗3次。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗牛IgG 50 μ L,37℃感作30 min。用 PBS洗3次。每孔加入50 μ L顯色液(二氨基聯(lián)苯胺5 mg/10 mL,H2O210 μ L/10 mL,pH 7.5)37℃顯色,當(dāng)陽性血清的抗原小片上呈現(xiàn)深棕色或淺棕色斑點(diǎn),而陰性血清的抗原小片尚未呈現(xiàn)斑點(diǎn)時(shí)甩盡底物液,加雙蒸餾水終止反應(yīng),確定最佳抗原量。

1.4.2 血清工作濃度的確定 將陽性血清及陰性血清按 50、100、200、400 倍稀釋,進(jìn)行 Dot-ELISA,確定血清工作濃度。

1.5 特異性試驗(yàn)

1.5.1 阻斷試驗(yàn) 將牛新孢子蟲病陽性血清、陰性血清倍比稀釋后,加入適量的抗原液,于37℃感作1 h,然后Dot-ELISA檢測其抗體滴度,同時(shí)以未作任何處理的陽性血清作對照。

1.5.2 交叉反應(yīng)試驗(yàn) 用牛新孢子蟲病陽性血清及陰性血清、弓形蟲陽性血清、牛瑟氏泰勒蟲陽性血清進(jìn)行Dot-ELISA檢測,重復(fù)2次。

1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 將牛新孢子蟲病陽性及陰性血清1∶100稀釋后,用不同批次的抗原片進(jìn)行Dot-ELISA檢測,重復(fù)4次。

1.7 Dot-ELISA與ICT檢測結(jié)果的比較 應(yīng)用建立的Dot-ELISA對30頭份被檢血清樣本進(jìn)行檢測,同時(shí)進(jìn)行ICT檢測[6]。

2 結(jié)果

2.1 新孢子蟲抗原蛋白濃度的測定 制備的新孢子蟲抗原測定的蛋白質(zhì)濃度為0.80 mg/mL。2.2 新孢子蟲抗原的特異性分析 新孢子蟲可溶性抗原經(jīng)SDS-PAGE電泳和Western blot結(jié)果顯示,76、63、46 ku和27 ku的抗原與新孢子蟲陽性血清表現(xiàn)出明顯的反應(yīng)原性,而與陰性血清無特異性反應(yīng)(如圖1)。

圖1 新孢子蟲可溶性抗原免疫印跡分析

2.3 Dot-ELISA反應(yīng)參數(shù)的確定

2.3.1 最適抗原濃度的確定 Dot-ELISA檢測結(jié)果表明,抗原的最適濃度范圍為10～40 μ g/mL。在該范圍內(nèi),標(biāo)準(zhǔn)陽性血清呈深棕色斑點(diǎn),而標(biāo)準(zhǔn)陰性血清不呈現(xiàn)斑點(diǎn)。為了方便計(jì)算以20 μ g/mL作為最適工作濃度。

2.3.2 血清工作濃度的確定 將陽性血清及陰性血清分別按 50、100、200、400 倍稀釋,然后進(jìn)行Dot-ELISA檢測。結(jié)果表明當(dāng)稀釋度為1∶100時(shí),反應(yīng)強(qiáng)度最高,故選擇1∶100作為最適血清工作濃度。

2.4 特異性試驗(yàn)

2.4.1 阻斷試驗(yàn) 未處理的陽性對照血清終點(diǎn)滴度分別為1∶1 600和1∶100,而經(jīng)診斷抗原處理后滴度分別為1∶50和1∶30,說明反應(yīng)被特異性阻斷。2.4.2 交叉反應(yīng)試驗(yàn) 用弓形蟲陽性血清和牛瑟氏泰勒蟲病陽性血清按所建立的Dot-ELISA進(jìn)行檢測,重復(fù)2次,結(jié)果只有陽性對照血清呈現(xiàn)陽性反應(yīng),其余均呈現(xiàn)陰性反應(yīng)。表明所建立的Dot-ELISA具有較高的特異性。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 將牛新孢子蟲病陽性及陰性血清1∶100稀釋后,用不同批次的抗原片進(jìn)行Dot-ELISA檢測,重復(fù)4次,其變異系數(shù)小于10%,說明Dot-ELISA具有良好的重復(fù)性。

2.6 Dot-ELISA和ICT檢測結(jié)果比較 對30份牛血清樣本的檢測結(jié)果見表1。

由表1可見,Dot-ELISA的陽性率為40%(12/30),ICT的陽性率也為40%(12/30),而且Dot-ELISA檢測為陽性的12份樣本ICT檢測也均為陽性,二者的陽性符合率達(dá)100%(12/12),說明建立的Dot-ELISA具有較好的敏感性。

表1 Dot-ELISA和ICT對30頭份血清的檢測結(jié)果

3 討論

目前,國內(nèi)外廣泛應(yīng)用IFAT、ELISA、ICT等方法檢測新孢子蟲病,但使用抗原均為重組蛋白,在不同程度上將會影響檢測結(jié)果的敏感性和特異性。本試驗(yàn)首先對新孢子蟲抗原進(jìn)行分析,應(yīng)用含有76、63、46 ku和27 ku的新孢子蟲特異性抗原建立了牛新孢子蟲Dot-ELISA檢測方法。所建立的Dot-ELISA不與弓形蟲病陽性血清和牛瑟氏泰勒蟲陽性血清發(fā)生交叉反應(yīng),說明該法具有較高的特異性。

IFAT、ELISA、ICT等方法檢測新孢子蟲抗體成本較高,而且需要專門儀器設(shè)備和專業(yè)人員操作。而Dot-ELISA不但具備常規(guī)ELISA敏感、特異等特點(diǎn),還具有簡便快捷、經(jīng)濟(jì)、無需儀器設(shè)備、適合基層獸醫(yī)臨床應(yīng)用等優(yōu)點(diǎn)。本試驗(yàn)用Dot-ELISA和ICT同時(shí)檢測30頭份被檢血清的結(jié)果顯示,二者的陽性符合率達(dá)100%。鑒于Dot-ELISA具有特異、敏感、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn),因此,該方法完全適用于基層獸醫(yī)部門進(jìn)行牛新孢子蟲抗體檢測及該病的疫情監(jiān)測。

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