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高低不同轉(zhuǎn)移特性骨肉瘤亞克隆細(xì)胞系的分離與鑒定及其Cofilin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的相關(guān)性研究

2010-05-30 10:36趙建武高忠禮
關(guān)鍵詞:包被孔板單克隆

婁 楠,王 巖,趙建武,王 洋,高忠禮*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院,吉林長(zhǎng)春130033;2.吉林大學(xué)病理生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

近年來(lái)已有學(xué)者[1]通過(guò)對(duì)骨肉瘤的研究,使用單細(xì)胞克隆篩選的方法,得到高侵襲的細(xì)胞亞群。而我們采用不同方法,先分離得到holoclone后通過(guò)多個(gè)成骨細(xì)胞分化標(biāo)志物檢測(cè),得到高侵襲及高致瘤的骨肉瘤細(xì)胞株。并對(duì)這些骨肉瘤細(xì)胞株進(jìn)行了一系列的鑒定試驗(yàn)。對(duì)其中的高侵襲單克隆細(xì)胞株在Cofilin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。

1 材料和方法

1.1 材料

人成骨肉瘤細(xì)胞MG-63購(gòu)自ATCC。高糖DMEM(H-DMEM)Gibico USA 、優(yōu)等胎牛血清(FBS)Hyclone USA,胰酶Promega USA,DMSO天佳生物科技有限公司 China,DEPC鼎國(guó)生物科技有限公司China,Trizol Invitrogen USA、RT-PCR Kit TaKaRa Japan,Triton X-100、PISigma USA,RNA 提取試劑(Trizol-Reagent)Invitrogen USA,RNase free DNase I Promega USA,RT試劑盒TaKaRa Japan,PCR引物由TaKaRa合成。

1.2 克隆篩選

采用有限稀釋法,將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的骨肉瘤MG-63細(xì)胞在96孔板中稀釋成每孔含0.5-1個(gè)細(xì)胞,在克隆化后3-5 d選出僅含有單個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)的并生長(zhǎng)成完全克隆的孔進(jìn)行標(biāo)記,待細(xì)胞增殖至孔面積1/3時(shí)(即細(xì)胞數(shù)超過(guò)600個(gè)),將細(xì)胞移至24或48孔板中擴(kuò)大培養(yǎng),后再轉(zhuǎn)至6孔板,最后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶,后行細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)鑒定。

1.3 生物學(xué)特性鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué) 相差顯微鏡拍攝有限稀釋法分離得到的各單克隆細(xì)胞亞系的細(xì)胞形態(tài)。

1.3.2 腫瘤細(xì)胞遷移能力的檢測(cè)(劃痕實(shí)驗(yàn))用0.25%胰蛋白酶消化體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/ml,分別將100 μ l細(xì)胞懸液接種于預(yù)包被的96孔培養(yǎng)板中。每組平行8個(gè)樣本。人工劃痕:在單層培養(yǎng)細(xì)胞上,用移液器滴頭沿培養(yǎng)板底部呈“一”字形劃痕,用激光共聚焦顯微鏡攝像,并測(cè)量劃痕區(qū)距離(A值),培養(yǎng)24小時(shí),觀察并照相。測(cè)量遷移距離:用激光共聚焦顯微鏡攝像,并測(cè)量相同劃痕區(qū)的遷移后的距離(B值),根據(jù)下面公式計(jì)算出細(xì)胞實(shí)際遷移距離。相對(duì)移動(dòng)距離=(A-B)/A×100,結(jié)果用±s表示。

1.3.3 Boyden小室遷移侵襲實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)共設(shè)3組,包括A3組、D1組和MG63組。包被先將Matrigel置4℃融化,并用無(wú)血清培養(yǎng)基將其1∶3稀釋,混勻,60 μ l/孔加至Boyden小室的上室聚碳酸酯膜上,整個(gè)操作在冰上及無(wú)菌條件下進(jìn)行,所有器皿及試管均事先預(yù)冷。37℃下孵育30 min,此時(shí)Matrigel已形成膠。熒光標(biāo)記細(xì)胞,將各組細(xì)胞用0.25%胰酶消化,離心,PBS洗一次,離心棄洗液,加入1 mg/ml羅丹明,靜止2-3 min,離心1 000 rpm,5分鐘。PBS洗一次。

上室加入各組細(xì)胞5×105個(gè)/孔,于37℃5%CO2條件下培養(yǎng)。在細(xì)胞接種2小時(shí)末,分別在激光共聚焦顯微鏡下,觀察細(xì)胞距離孔徑的距離,用以判斷細(xì)胞在Matrigel內(nèi)的遷移速度及侵襲距離。培養(yǎng)4-6小時(shí),棄去上室中的培養(yǎng)液,并用生理鹽水棉簽輕輕檫去Matrigel膠,用激光共聚焦顯微鏡200×視野下任取5個(gè)不重復(fù)視野照相,并記數(shù)細(xì)胞數(shù)量±s表示。

1.3.4 腫瘤細(xì)胞在ECM上粘附的測(cè)定 包被基底膜:用滅菌雙蒸水分別配制以下三種溶液:10 g/L BSA;50 mg/L Matrigel 1∶8稀釋液 ;10 mg/L FN,以 50 μ l/每孔分別加入96孔培養(yǎng)板,4℃過(guò)夜。水化基底膜:吸出培養(yǎng)板中殘余液體,每孔加入50 μ l含10 g/L BSA的無(wú)血清培養(yǎng)液,37℃,30分鐘。接種細(xì)胞:用0.25%胰蛋白酶消化體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/ml,分別將100 μ l細(xì)胞懸液接種于包被后的96孔培養(yǎng)板中。每組平行16個(gè)樣本。培養(yǎng)細(xì)胞,根據(jù)CCK-8比色法測(cè)定經(jīng)過(guò)清洗的各孔細(xì)胞的光吸收值并計(jì)算平均值,結(jié)果用±s表示。

1.3.5 RT-PCR 應(yīng)用Trizol Reagent提取細(xì)胞總RNA,用 RNase free DNase I對(duì)所獲樣品進(jìn)行處理,除去可能污染的DNA分子。應(yīng)用RT試劑盒將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)分析采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行t檢驗(yàn),P<0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞單克隆大體形態(tài)

96孔板中成功分離單細(xì)胞生長(zhǎng)的約為60個(gè),其中有23個(gè)克隆成功傳至培養(yǎng)瓶中繼續(xù)生長(zhǎng),余者皆發(fā)生凋亡或無(wú)法繼續(xù)傳代,在同等培養(yǎng)情況下,傳至8-12代又有3個(gè)單克隆細(xì)胞亞系出現(xiàn)自發(fā)性的死亡,而無(wú)法繼續(xù)傳代。而分離出各單克隆細(xì)胞亞系的細(xì)胞大體形態(tài)差異顯著(10倍鏡下)。

2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)

多數(shù)克隆與克隆前相似,以短梭形和多邊形為主,細(xì)胞排列緊密,胞體大,突起細(xì)長(zhǎng),無(wú)接觸抑制,易于堆疊,結(jié)團(tuán),A3形體稍小。另一類(lèi)呈長(zhǎng)梭形(A1,D1)胞體小,胞漿豐富,突起寬而短,有一定接觸抑制,容易形成單細(xì)胞層。

2.3 劃痕實(shí)驗(yàn)

我們選取大體形態(tài)具有代表性的8個(gè)單克隆細(xì)胞株進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定,其中A3的倍增時(shí)間明顯短于其他單克隆細(xì)胞株,存在明顯差異。選取細(xì)胞都在4-16代之間,每次實(shí)驗(yàn)各克隆選取的細(xì)胞均為同一代次。而其中D1克隆則隨著代次的增加,細(xì)胞增殖速度逐漸加快。

2.4 Boyden小室侵襲實(shí)驗(yàn)

在接種細(xì)胞后3 h至6 h,動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞侵襲距離,A3組細(xì)胞穿行距離明顯大于其他3組。6 h時(shí)觀察穿過(guò)Matrigel膠侵襲的細(xì)胞數(shù),可見(jiàn)A3組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯多于其他3組,其間差異顯著。A3、D1、MG63、A1細(xì)胞穿過(guò)人工基底膜膠侵襲細(xì)胞數(shù)分別為185.0±16.5、154.0±11.2、129.2±14.35和73.0±11.2。A3組穿膜侵襲細(xì)胞數(shù)與MG63比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

2.5 細(xì)胞株黏附能力的測(cè)定

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,A3、A1、D1、MG63四系黏附細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯差異(P>0.05)(表1)。細(xì)胞鋪展過(guò)程觀察顯示:在BSA包被的孔板中,各組細(xì)胞均不黏附鋪展,細(xì)胞為圓形;在Matrigel及FN包被的孔板中,雖然A3組同其他組的黏附細(xì)胞數(shù)量比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但其細(xì)胞多數(shù)鋪展良好,細(xì)胞由圓形變?yōu)椴灰?guī)則圓形,鏡下細(xì)胞體積大,部分細(xì)胞伸出多個(gè)突起。

表1 細(xì)胞株黏附能力

2.6 RT-PCR表達(dá)

A3細(xì)胞株LIMK1高表達(dá)。D1的SSH1 L表達(dá)略高于其它單克隆。見(jiàn)圖2。

3 討論

圖1 MG63母系細(xì)胞及各單克隆亞系細(xì)胞侵襲能力

圖2 RT-PCR檢測(cè)MG63各單克隆亞系細(xì)胞LIMK-1和SSH1L的基因表達(dá)

最新研究報(bào)道:Cofilin在蛋白質(zhì)水平的過(guò)量表達(dá)提高了腫瘤細(xì)胞遷移的速率[2],Cofilin表達(dá)的抑制能顯著減少腫瘤細(xì)胞的入侵。而Cofilin在mRNA水平的過(guò)量表達(dá)已經(jīng)在腫瘤細(xì)胞(如乳房腫瘤)亞群中檢測(cè)到[3]。在本次研究中,通過(guò)有限稀釋法得到的骨肉瘤單克隆細(xì)胞株雖然在大體形態(tài)存在極為顯著的差異,但在蛋白質(zhì)水平上Cofilin總量表達(dá)并無(wú)明顯差異,而具有高侵襲和遷移能力的A3細(xì)胞株P(guān)-Cofilin表達(dá)較其他單克隆顯著增高,即Cofilin的磷酸化程度增高。這也能夠說(shuō)明Cofilin相關(guān)的信號(hào)通路介導(dǎo)了骨肉瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移,

近年來(lái)LIMK-1在腫瘤發(fā)生中的意義引起了廣泛關(guān)注[4,5]。有研究發(fā)現(xiàn),LIMK-1在人乳腺癌生長(zhǎng)、血管發(fā)生和侵襲中起重要作用[6]。另有報(bào)道,LIMK-1在前列腺腫瘤和前列腺癌細(xì)胞株中有過(guò)度表達(dá),并且轉(zhuǎn)移的前列腺癌細(xì)胞中也有高濃度磷酸化的Cofilin;抑制LIMK-1后能使細(xì)胞靜止在G/M期從而改變細(xì)胞增殖、細(xì)胞形態(tài),遏制轉(zhuǎn)移性前列腺癌細(xì)胞的侵襲性[7]。在李振華[8]等人的研究表明通過(guò)RNAi技術(shù),抑制LIMK-1在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)則直接導(dǎo)致骨肉瘤細(xì)胞遷移及侵襲能力的下降,而在我們本次研究中高侵襲力單克隆細(xì)胞株A3 LIMK-1表達(dá)量明顯高于其他單克隆細(xì)胞株,我們推斷A3細(xì)胞株正是MG63骨肉瘤異質(zhì)成分中高侵襲力的部分,而LIMK-1在骨肉瘤侵襲的過(guò)程中扮演了相當(dāng)重要的角色。通過(guò)對(duì)其侵襲能力的抑制就能夠達(dá)到對(duì)骨肉瘤早期轉(zhuǎn)移和侵襲的有效預(yù)防和治療,而通過(guò)抑制LIMK1活性來(lái)抑制骨肉瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲,無(wú)疑具有廣闊的研究前景。在我們的研究中D1細(xì)胞株SSH1L表達(dá)較其他克隆略高,可推斷其Cofilin的磷酸化程度必然降低,即P-Cofilin表達(dá)水平降低。通過(guò)侵襲試驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)其侵襲能力低于母系,說(shuō)明Cofilin通路關(guān)鍵基因的改變確與骨肉瘤細(xì)胞株侵襲力的高低有著非常密切的關(guān)系。而軟瓊脂集落試驗(yàn)中此細(xì)胞株具有非常強(qiáng)的成瘤能力,明顯高于母系及其他細(xì)胞株。梅紅[9]等研究表明包括雌激素在內(nèi)的很多刺激因子可以通過(guò)PI3K/AKT/SSH1L信號(hào)傳導(dǎo)通路下調(diào)SSH1L,促進(jìn)hMSCs的增殖和成骨分化,而D1細(xì)胞株SSH1L的表達(dá)異常是否也與成骨肉瘤細(xì)胞的多項(xiàng)分化潛能有關(guān),我們也將就此進(jìn)行更為深入細(xì)致的研究。

[1]石曉兵,陳安民.不同轉(zhuǎn)移特性人成骨肉瘤MG2 63細(xì)胞亞系的建立及特征[J].中國(guó)矯形外科雜志,2004,12(21):1675.

[2]Yamaguchi H,Condeelis J.Regulation of the actin cytoskeleton in cancer cell migration and invasion[J].Biochim Biophys Acta,2007,1773(5):642.

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[8]李振華.LIMK1表達(dá)對(duì)人成骨肉瘤細(xì)胞生物學(xué)活性影響的體外研究[J].2008,04:01.

[9]梅紅.雌激素在hMSCs成骨和成脂肪誘導(dǎo)分化中的作用及機(jī)制研究[J].吉林大學(xué),2008(04):01.

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