許淑芬,劉 磊,孫牧男,趙 帥,方艷秋,譚 巖

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院中心實驗室,吉林長春130021)

BNP是1988年日本學(xué)者Sudoh[1]最初由豬腦分離出來的一種32個氨基酸構(gòu)成的多肽類神經(jīng)激素,曾被命名為腦鈉肽(brain natriuretic peptide),是心室分泌的激素樣短肽,具有利尿利鈉效應(yīng),能夠舒張血管抑制醛固酮分泌及腎素活[2,3]。近年來由于發(fā)現(xiàn)血漿BNP水平在各種心血管疾病,尤其是心室功能不全、急性心肌梗死(AMI)、高血壓等疾病的診斷、治療及預(yù)后等方面有重要指導(dǎo)意義[4-7],引起臨床工作者的高度重視,因此建立快速檢測BNP的方法成了研究熱點。本研究通過基因工程技術(shù)制備人BNP蛋白,為制備BNP的單克隆抗體、提供BNP測定的潛在質(zhì)控物和實現(xiàn)BNP檢測試劑國產(chǎn)化打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 大腸桿菌JM109、BL21、原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6P-1(本室保存),人心肌組織(吉林大學(xué)第一醫(yī)院婦產(chǎn)科提供),pGEM-T easy載體(美國Promega公司),限制性核酸內(nèi)切酶 BamH Ⅰ 、SalⅠ 、T4 DNA連接酶(TAKARA公司),Trizol(Ivit rogen公司),AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega公司),質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒(Vitagene公司),Glutathione Sepharose○R4B親和層析柱(Qiagen公司),抗 B型鈉尿肽單克隆抗體(北京晶美公司),生物素標(biāo)記的馬抗小鼠IgG及辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素(北京鼎國生物公司)。

1.1.2 寡核苷酸引物設(shè)計與合成 遵循PCR引物設(shè)計的原則,根據(jù)GenBank(NM002521)的人B型鈉尿肽cDNA序列,設(shè)計編碼B型鈉尿肽基因片段的5′和3′端寡核苷酸引物,并在各自 5′末端分別引入BamH Ⅰ和SalⅠ限制性酶切位點,在3′端引物的5′端引入了一個半胱氨酸。引物由大連寶生物工程公司合成 。P1:5′-ATGGATCCAGCCCCAAGATGGTG-3′;P2:5′-AAGACGTCTTAACAATGCCGCCTCAGC-3′。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR擴(kuò)增及測序 Trizol法從人心肌組織中提取總RNA,提取方法按照說明書進(jìn)行,紫外分光光度計測RNA的A值并計算含量。cDNA的合成按說明書操作,并以此為模板PCR獲得B型鈉尿肽基因雙鏈DNA。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收PCR產(chǎn)物,將純化后PCR產(chǎn)物克隆至pGEM-T-easy載體,將構(gòu)建的pGEM-BNP轉(zhuǎn)化大腸桿菌高感受態(tài)細(xì)菌JM109,經(jīng)過藍(lán)白篩選,酶切、PCR鑒定初篩陽性克隆菌株,由大連寶生物工程公司測序。

1.2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建 將測序正確的重組克隆質(zhì)粒pGEM-BNP和表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6P-1分別進(jìn)行BamH Ⅰ、SalⅠ雙酶切,凝膠回收,切取的BNP基因目的片段經(jīng)T4 DNA連接酶插入pGEX-6P-1構(gòu)建出重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6P-BNP,將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)抗生素耐藥性鑒定、酶切鑒定、PCR鑒定篩選出陽性克隆。

1.2.3 BNP陽性克隆菌株的誘導(dǎo)表達(dá) 陽性克隆菌接種于LB固體培養(yǎng)基(氨芐青霉素+、氯霉素+),挑選4個重組菌單菌落分別接種于2 ml LB液體培養(yǎng)基(含100 mg·L-1氨芐青霉素和50 mg·L-1氯霉素),37℃160 r·min-1振搖過夜,次日以1∶50 接種于2 ml LB液體培養(yǎng)基中,30℃230 r·min-1振蕩培養(yǎng)至A600值0.4-0.6,加入IPTG至終濃度1.0 mmol·L-1,繼續(xù)培養(yǎng) 5 h,4℃12 000 g 離心1 min,收集菌體,加入裂解液(50 mmol·L-1Tris-HCL),12 000 g離心,分別取上清和沉淀加入等量的2×SDS變性緩沖液,SDS-PAGE電泳顯示表達(dá)的BNP多數(shù)以沉淀的包涵體形式存在。

1.2.4 Western blotting印記分析 將電泳顯示目的蛋白表達(dá)量較高的菌株沉淀行15%SDS-PAGE,用半干式轉(zhuǎn)移電泳儀電轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜3 h,3%BSA封閉液4℃過夜,1×PBS洗膜,加入鼠抗人B型鈉尿肽單抗(1∶1 000),37℃結(jié)合2 h,洗膜,加入馬抗小鼠IgG(1∶1 000),37℃結(jié)合2 h,洗膜,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素(1∶1 000),37℃結(jié)合2 h,充分洗滌后DAB顯色鑒定表達(dá)產(chǎn)物。

1.2.5 B型鈉尿肽包涵體的提取及純化 誘導(dǎo)200 ml陽性表達(dá)菌液,離心收集菌體沉淀,超聲裂解菌體,離心得到的蛋白包涵體用變性裂解緩沖液重懸,4℃過夜變性至溶液清亮后經(jīng)Glutathione Sepharose○R 4B親和層析法純化,SDS-PAGE電泳。

1.2.6 B型鈉尿肽表達(dá)量測定 變性后的包涵體上清SDS-PAGE電泳圖象經(jīng)凝膠電泳圖象分析儀掃描分析得到B型鈉尿肽相對含量。

2 結(jié)果

2.1 人B型鈉尿肽基因的克隆

RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖1。電泳結(jié)果顯示,有與預(yù)期大小一致的DNA條帶(約110 bP)。

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及酶切鑒定

將人B型鈉尿肽基因插入載體pGEX-6P-1,構(gòu)建成重組質(zhì)粒pGEX-6P-BNP,重組質(zhì)粒經(jīng)BamH 、SalⅠ雙酶切后產(chǎn)生約110 bp大小的目的片段(圖2)。

2.3 重組蛋白的表達(dá)篩選

將含重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6P-BNP的大腸桿菌BL21經(jīng)1 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)后,SDS-PAGE結(jié)果顯示表達(dá)一條相對分子質(zhì)量約為29 KD的蛋白(圖3)。動力學(xué)實驗表明5 h表達(dá)量最高。

2.4 Western blotting印記分析

為證實表達(dá)蛋白的生物學(xué)特性,用鼠抗人B型鈉尿肽單克隆抗體為一抗進(jìn)行Western blot印記分析,在29 KD處呈現(xiàn)強特異性顯色反應(yīng)(圖4)。

2.5 Glutathione Sepharose○R4B親和層析柱純化目的蛋白

SDS-PAGE結(jié)果顯示電泳純(圖4)。

3 討論

圖1 BNP成熟肽cDNA擴(kuò)增結(jié)果

圖2 重組質(zhì)粒pGEX-6PBNP的PCR及酶切鑒定

圖3 在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)BNP的SDS-PAGE分析

圖4 BNP蛋白的親合純化和Western blotting印記分析

人體血漿中BNP的主要形式是含有特異性環(huán)狀結(jié)構(gòu)的32肽,分子量約為3.2 KD,主要來源是心室,因而人們推測血漿中BNP是心室疾病的敏感且特異的標(biāo)志物[8]。經(jīng)過多年的研究,BNP在心力衰竭中的診斷價值得到了多數(shù)學(xué)者的肯定?，F(xiàn)在認(rèn)為人血漿BNP水平的測定能被用于心力衰竭的診斷、心力衰竭的預(yù)后判斷、心力衰竭治療的監(jiān)控、評價左心室功能不良程度、提示心內(nèi)壓力、對急性冠心病的預(yù)后判斷等[9]。檢測BNP的方法有免疫放射分析IRMA、免疫熒光法等,IRMA法由于半衰期短、測定時間長不適合于心臟病的急性診斷和小樣本檢測,適合于回顧性分析。國內(nèi)對BNP的研究主要在利用國外進(jìn)口試劑進(jìn)行BNP檢測的臨床應(yīng)用。本研究旨在建立檢測人血漿BNP的免疫學(xué)方法,使BNP檢測試劑國產(chǎn)化、快速化。本項目根據(jù)GenBank(NM002521)人BNPDNA序列,采用RT-PCR技術(shù)從人心肌組織中獲得BNPcDNA序列,并構(gòu)建了GSTBNP融合蛋白的表達(dá)質(zhì)粒,表達(dá)載體pGEX-6P-1是一種較為高效的蛋白表達(dá)載體,含有強啟動子tac及Lac操縱基因、SD序列及l(fā)ac阻遏蛋白基因等。此載體SD序列的下游是GST基因,GST基因下游和多克隆位點上游間有編碼凝血酶識別位點的序列。本試驗中,GST-BNP表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后,融合蛋白以包含體表達(dá)為主,用親和層析分離純化,每升誘導(dǎo)菌可得500 mg融合蛋白,GST-BNP表達(dá)量高。DNA測序、融合蛋白的分子量分析、Western-blot證實了GST-BNP蛋白的正確性,在3′端引入的半胱氨酸對BNP的蛋白折疊沒有影響。BNP分子量僅為3.2 KD,是半抗原,不能直接免疫動物制備抗體。本實驗制備的GST-BNP融合蛋白很好的解決了這一問題,GST-BNP融合蛋白能直接免疫動物制備抗體。因此本實驗制備的人BNP抗原既具有免疫原性又具有反應(yīng)原性。由于GST與BNP之間存在凝血酶識別位點,所以容易把BNP從GST-BNP中分離,得到單一的BNP,可以作為競爭性或包被抗原用于酶免分析中,為進(jìn)一步試劑開發(fā)打下基礎(chǔ)。

[1]SudohT,Kangawa K,Minamino N,et al.A new natriuretic peptide in poreine brain[J].Nature,1988,332(6159):78.

[2]Yasue H,Yoshimura M,Sumida H,et al.Localization and mechanism of secretion of B-type natriuretic peptide in comparison with those of A-type natriuretic peptide in normal subjects and patients woth heart failure[J].Circulation,1994,90:195.

[3]Peacock WF.The B-type natriuretic peptide assay:a rapid test for heart failure[J].Cleve Clin J Med,2002,69:243.

[4]Richards AM,NichollsMG,Espiner EA,et al.B-type natriuretic peptides and ejection fraction for prognosis after myocardial infarction[J].Circulation,2003,107:2786.

[5]張國華,胡 韻,史曉敏.B型鈉尿肽的生物學(xué)特性及其在心臟病學(xué)中的臨床應(yīng)用進(jìn)展[J].中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2004,27:262.

[6]Parekh N,Maisel AS.Utility of B-natriuretic peptide in the evaluation of left ventricular diastolic function and diastolic heart failure[J].Curr Opin Cardiol,2009,24(2):155.

[7]Potter LR,Yoder AR.Natriuretic peptides:their structures,receptors,physiologic functions and therapeutic applications[J].Handb Exp Pharmacol,2009,(191):341.

[8]Natrjuretic peptide testing:a window into the diagnosis and prognosis of heart failure[J].Cleve Clin J Med,2006 Feb,73(2):149.

[9]Jarai R,Wojta J,Huber K.Circulating B-type natrjuretic peptides in patients with acute corunary syndromes.Pathophysiological,prognostica;and therapeutical considerations[J].Thromb Haemost,2005 Nov,94(5):926.