吳 荒,孫 瑩,張小猛,劉喜春,張 靈,吳雅臻*

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院,吉林長春130041;2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院;3.吉林大學(xué)前列腺疾病防治研究中心)

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤是15歲以下兒童中最常見的原發(fā)性眼內(nèi)惡性腫瘤[1-3]。Survivin屬于凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins,IAP)家族成員。具有控制有絲分裂和對抗細(xì)胞凋亡兩種作用[4]。Survivin基因在分化完全的組織中不表達(dá)或低表達(dá);在大多數(shù)癌癥組織中卻有很強(qiáng)的表達(dá)[5]。本研究建立裸鼠視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤玻璃體移植瘤模型,采用RNA干涉技術(shù),探討Survivin-siRNA對腫瘤細(xì)胞中Survivin表達(dá)的抑制以及對腫瘤細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。

1 材料和方法

1.1 材料和對象 帶有U6啟動子及GFP的質(zhì)粒pGCsilencer-U6/Neo/GFP購于上海吉凱化學(xué)公司,全長6 380 bp。JM109由吉林大學(xué)前列腺疾病防治中心保存。Y79細(xì)胞株購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞所細(xì)胞庫。裸鼠購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所,4-6周齡,體重18-20 g,飼養(yǎng)于恒定溫度(22-25℃)、恒定濕度(40%-50%)的SPF層流室中,經(jīng)高壓滅菌的標(biāo)準(zhǔn)飼料和水供動物自由食用。

1.2 構(gòu)建Survivin-siRNA真核重組質(zhì)粒[6]根據(jù)shRNA的設(shè)計(jì)原則,針對Survivin mRNA特異的靶序列,合成針對其編碼區(qū)394-412位堿基序列寡核苷酸鏈,由上海生物工程技術(shù)有限公司合成:shRNASurvivin:5′-GATCCCGCAGTTTGAAGAATTAACCTTCAA GAGAGGTTAATTCTTCAAACTGCTTTTTGGAT-3′(sense strand),5′-AGCTATCCAAAAAGCAGTTTGAAGAATTAA CCTCTCTTGAAGGTTAATTCTTCAAACTGCGG-3′(antisense strand);shRNA-Scramble對照:堿基順序隨機(jī)排列,與人類基因的外顯子沒有同源性。合成的DNA在5′端和3′端分別帶有BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)的一部分?；パa(bǔ)寡核苷酸鏈退火后分別與BamHⅠ和HindⅢ線性化的載體相連,構(gòu)建重組質(zhì)粒pGCsilencer-U6-siRNA-survivin(以下簡稱Survivin-siRNA)和pGCsilencer-U6-siRNA-Scramble(以下簡稱ScramblesiRNA)。

1.3 裸鼠移植瘤模型建立 Y79細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)液內(nèi),置于含5%CO2,37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱。當(dāng)細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時,離心收集細(xì)胞,用Hank液洗滌細(xì)胞2次,用不含血清的IMDM培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞,細(xì)胞密度為(4.5-5.5)×107/ml。裸鼠21只,所有實(shí)驗(yàn)眼均選擇右眼,乙醚麻醉,復(fù)方托比卡胺滴眼液(美多麗)散瞳。在體式顯微鏡下,將鼠上下眼瞼撥開,可以眼球突出于瞼裂 ,使用5 μ l微量注射器吸取 5 μ l細(xì)胞懸液自角鞏膜緣部位刺入玻璃體腔,在玻璃體腔內(nèi)清晰看到注射器針尖,而后緩緩?fù)谱⒓?xì)胞懸液,注射后退針。每天觀察裸鼠各種生活變化,每隔3天采用乙醚麻醉,裂隙燈下觀察玻璃體腔內(nèi)情況。必要時可用蓋玻片輕壓角膜,即可觀察到后部玻璃體及眼底情況。

1.4 抑瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 將Y79細(xì)胞種植至21只裸鼠玻璃體腔內(nèi),于注射后9天進(jìn)行抑瘤實(shí)驗(yàn)。將21只裸鼠隨機(jī)分為3組:組1為mock對照組(n=7),注射 10 μ l K-PBS(NaCl 30.8 mmol/L 、KCl 20.7mmol/L、Na2HPO48.1 mmol/L 、KH2PO41.46 mmol/L 、MgCl210 mmol/L溶解于雙蒸水);組2為Scramble對照組(n=7),注射帶有非同源的Scramble-siRNA的重組質(zhì)粒;組3為Survivin實(shí)驗(yàn)組(n=7),注射特異性Survivin-siRNA重組質(zhì)粒。質(zhì)粒注射劑量為10 μ g/只,質(zhì)粒溶解于K-PBS,定量,調(diào)節(jié)質(zhì)粒濃度為1 mg/ml。在注射結(jié)束后均于注射局部實(shí)行電轉(zhuǎn)染以提高質(zhì)粒在瘤體內(nèi)的轉(zhuǎn)染效率。將兩根銀電極分別置于內(nèi)、外眥部位,輕壓即可見眼球突出,此時玻璃體腔內(nèi)腫瘤位于電極中央。電脈沖治療儀的參數(shù)設(shè)定:電場強(qiáng)度為500 V/cm,脈沖時值5 μ s,次數(shù) 2次,頻率 1 Hz。觀察裸鼠各種生活變化,觀察腫瘤大小變化。在給藥后10天摘除眼球,完整剝離腫瘤,一部分用10%甲醛液固定;另一部分新鮮組織提取總RNA和總蛋白。

1.5 半定量RT-PCR檢測Survivin基因表達(dá) 取轉(zhuǎn)染組織100 mg,用玻璃勻漿器充分勻漿。用Trizol試劑盒提取總RNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。遵循PCR引物設(shè)計(jì)原則,根據(jù)GeneBank人Survivin基因和β-actin基因cDNA序列分別設(shè)計(jì)引物并由上海生物工程公司合成。Survivin上游引物:5′-GAATTCA TGGGTGCCCCGACGTTGCC-3′;下游引物 :5′-AGATCTTTCTTCTTATTGTTGGTTTCC-3′,擴(kuò)增片斷長度為475 bp。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件:首先94℃5 min;而后94℃變性30 s,59℃退火45 s,72℃延伸2 min,共30個循環(huán);最后72℃延伸5 min。β-actin作為內(nèi)參照,其擴(kuò)增片段長度為630 bp。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析,紫外燈下拍照。

1.6 Western blotting檢測Survivin蛋白表達(dá) 對轉(zhuǎn)染后72 h的組織進(jìn)行裂解,應(yīng)用Bio-rad測定蛋白含量。取總蛋白 50 μ g作SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后,將PVDF膜用甲醇平衡30 s,用Blotting buffer將膜、膠及Whatman濾紙浸泡10 min,用電轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)移到 PVDF膜上。PVDF膜用 Blocking buffer(5%脫脂奶粉)封閉4℃過夜。按Western blot流程依次加入survivin兔抗人多克隆抗體(1∶100),堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔多克隆二抗(1∶2 000),用顯色液顯色,晾干拍照。

1.7 Survivin及Ki67免疫組化染色 取10%甲醛固定后的組織,石蠟包埋,4 μ m連續(xù)切片分別行HE染色和免疫組織化學(xué)染色。Survivin免疫組化染色:以在腫瘤細(xì)胞胞漿或細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒,且著色強(qiáng)度高于背景非特異性染色者判定為陽性。Ki67免疫組化染色:以腫瘤細(xì)胞核呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色細(xì)顆粒為陽性,每張切片觀察3個視野,每個視野連續(xù)數(shù)出300個細(xì)胞,并且計(jì)算增殖指數(shù)(PI)。PI(%)=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.8 TUNEL法檢測腫瘤組織凋亡 按TUNEL凋亡檢測試劑盒(北京中山公司)說明書進(jìn)行操作。石蠟切片做凋亡檢測。細(xì)胞核染為棕黃色的即為凋亡細(xì)胞。每張切片觀察3個視野,每個視野連續(xù)數(shù)300個細(xì)胞,計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞百分比即為凋亡指數(shù)(AI)。AI(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 利用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理。半定量RT-PCR及Western blot均分別做3次。Ki67免疫組化染色計(jì)算增殖指數(shù)及TUNEL法計(jì)算凋亡指數(shù),每組均隨機(jī)選擇3只動物的病理切片,每張切片觀察3個視野,即每組9個數(shù)據(jù)進(jìn)行多個樣本間比較的方差分析,具體采用Bonferroni檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建重組質(zhì)粒 重組質(zhì)粒Scramble-siRNA和Survivin-siRNA轉(zhuǎn)化JM109后,小量提取質(zhì)粒,分別選取陽性克隆進(jìn)行測序,結(jié)果與所設(shè)計(jì)的寡核苷酸序列一致,證明真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功[6]。

2.2 抑瘤實(shí)驗(yàn)觀察 組1為mock對照組(n=7);組2為Scramble-siRNA對照組(n=7);組3為Survivin-siRNA實(shí)驗(yàn)組(n=7)。組 1、組2、組3腫瘤均繼續(xù)生長。但組3腫瘤組織較干燥,眼周新鮮血管組織較少,組1與組2的生長狀況無差別。組3中有一例發(fā)生了眼球萎縮,腫瘤消失。

2.3 半定量RT-PCR檢測腫瘤組織Survivin mRNA的表達(dá) 運(yùn)用GIS凝膠分析軟件光密度掃描分析,以mock組Survivin產(chǎn)物與內(nèi)參β-actin產(chǎn)物的電泳亮度比值定為1,Scramble-siRNA組(0.95±0.03)與mock組無差別(P＞0.05),實(shí)驗(yàn)組(0.27±0.06)亮度明顯減弱(P＜0.01),見圖1。這表明重組質(zhì)粒SurvivinsiRNA在mRNA水平上抑制了Survivin基因轉(zhuǎn)錄。

圖1 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后Y79移植瘤中Survivin mRNA的半定量RT-PCR分析

2.4 Western blot方法分析Survivin蛋白的表達(dá)光密度掃描分析以mock組的Survivin與內(nèi)參β-actin的雜交帶亮度比值定為1,與mock組和ScramblesiRNA組(0.96±0.03)相比,實(shí)驗(yàn)組(0.30±0.09)細(xì)胞的Survivin蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.01)(見圖2)。Western blot結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了構(gòu)建的siRNA質(zhì)?？稍诘鞍姿缴弦种芐urvivin表達(dá)。

圖2 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后Y79移植瘤中Survivin蛋白的Western blot分析

2.5 組織形態(tài)學(xué)觀察 用蘇木素-伊紅(HE)染色普通光鏡下觀察,實(shí)驗(yàn)組與兩對照組相比,在瘤組織內(nèi)可見到較多死亡細(xì)胞,表現(xiàn)為較多細(xì)胞碎片,細(xì)胞核固縮碎裂,組織結(jié)構(gòu)消失,呈現(xiàn)無結(jié)構(gòu)嗜伊紅染色區(qū)等形態(tài)學(xué)改變。

2.6 免疫組化染色 Survivin表達(dá)的陽性顆粒主要位于腫瘤細(xì)胞的胞漿內(nèi),也可見于少數(shù)細(xì)胞核中。Survivin-siRNA組移植瘤組織中Survivin蛋白表達(dá)與mock組和Scramble-siRNA組相比明顯下降。

Ki67表達(dá)的陽性顆粒主要位于腫瘤細(xì)胞的胞核內(nèi),Survivin-siRNA組Ki67的表達(dá)較對照組下降明顯;增殖指數(shù)明顯下降(Mock組:63.67±7.26;Scramble-siRNA組:56.63±6.49;Survivin-siRNA組:8.67±5.24;P＜0.01)。

2.7 TUNEL法檢測腫瘤組織凋亡 Survivin-siRNA組腫瘤組織內(nèi)可見大量細(xì)胞核染為棕黃色的凋亡細(xì)胞,對照組可見少許凋亡細(xì)胞。治療組凋亡指數(shù)明顯高于對照組(Mock組:2.33±1.63;Scramble-siRNA組:3.67±1.75;Survivin-siRNA組:38.17±3.76;P＜0.01)。

3 討論

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤是兒童中最常見的原發(fā)性眼內(nèi)惡性腫瘤,出現(xiàn)首個體征的平均年齡為生后7個月(雙側(cè)發(fā)病病例)和24個月(單側(cè)發(fā)病病例)[7]。Survivin屬于凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins,IAP)家族成員,具有控制有絲分裂和對抗細(xì)胞凋亡兩種作用。Survivin在正常成人組織中幾乎不表達(dá),但在大多數(shù)癌癥組織中都有很強(qiáng)的表達(dá)。在癌細(xì)胞中,Survivin表達(dá)量增加與細(xì)胞增殖指數(shù)增加[8]、凋亡水平下降[9]、抵抗化療藥物能力增強(qiáng)[10]、腫瘤復(fù)發(fā)率增加相關(guān)[11]。我們在以往的研究中發(fā)現(xiàn),Survivin在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織中表達(dá)上調(diào)[12]。由于視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤具有特異的基因缺陷,可以對其進(jìn)行基因治療。如果采用特定的Survivin分子拮抗劑,抑制腫瘤組織中Survivin的表達(dá),就有可能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

本研究選擇了裸鼠作為荷瘤對象。采用的是經(jīng)裸鼠角鞏膜緣玻璃體腔內(nèi)注射種植的方法,此法操作簡便,便于腫瘤觀察。本研究觀察結(jié)果顯示,腫瘤在玻璃體腔內(nèi)生長速度較快:首先在玻璃體腔內(nèi)較為彌散生長,而后聚集成瘤,1周左右眼球結(jié)構(gòu)明顯破壞,兩周左右腫瘤明顯突出于眼外。

本研究采用RNA干涉技術(shù)。在種植后9天,將Survivin-siRNA導(dǎo)入裸鼠視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤玻璃體腔移植瘤中,此時腫瘤在眼內(nèi)已顯著生長,但眼球突出并不明顯。治療時將質(zhì)粒通過角鞏膜緣直接注射入玻璃體腔腫瘤內(nèi)部,而后進(jìn)行電轉(zhuǎn)染加強(qiáng)轉(zhuǎn)染效果。給藥后10天摘除眼球,完整剝離腫瘤。一部分新鮮腫瘤組織提取總 RNA和總蛋白,通過 RT-PCR在mRNA水平、Western blot在蛋白水平觀察到SurvivinsiRNA抑制了腫瘤組織中Survivin的表達(dá)。另一部分腫瘤組織用10%甲醛液固定,通過Survivin、Ki67免疫組化染色和TUNEL法檢測腫瘤組織凋亡均發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的凋亡較對照組明顯。本實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)了一個特例,即治療組中有一例在注射質(zhì)粒后眼球逐漸萎縮,腫瘤消失,全身狀態(tài)良好。尚無法證明此例是治療有效的體現(xiàn),因?yàn)橐暰W(wǎng)膜母細(xì)胞瘤本身存在自發(fā)性消退的現(xiàn)象,推測此例可能與此相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示,將構(gòu)建的Survivin-siRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤裸鼠玻璃體腔移植瘤中,抑制了腫瘤組織中Survivin基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá),誘導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步開展基因治療提供了更為直接的手段,為將來人類對視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的治療提供更多、更有效的選擇。

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