尤衛(wèi)艷，黃華宏，程龍軍，童再康，朱玉球

（浙江林學(xué)院 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 臨安 311300）

光皮樺Betula luminifera屬樺木科Betulaceae樺木屬Betula[1]，為中國(guó)特有優(yōu)良用材樹種，天然分布于秦嶺淮河流域以南的河南、四川、貴州、云南、安徽、湖北、湖南、廣東、廣西、江西、浙江、福建等10多個(gè)省（自治區(qū)）。其木材呈淡黃色或紅褐色，材質(zhì)細(xì)膩堅(jiān)韌，切面光滑，不撓不裂，干燥性能良好，廣泛應(yīng)用于航空、建筑、家具、造紙等各行業(yè)，也可用于提取木醇和芳香油等物質(zhì)。近年來(lái)光皮樺人工造林發(fā)展迅速，有關(guān)光皮樺的研究也不斷增多。在分子方面，謝一青等[2－3]通過(guò)對(duì)比和優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，建立光皮樺DNA提取及其隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）技術(shù)分析體系。同時(shí)陳偉[4]應(yīng)用RAPD和簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性（inter-simple sequence repeat，ISSR）技術(shù)對(duì)福建省光皮樺天然群體的的遺傳多樣性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)11個(gè)群體明顯分為兩大類。童再康等[5]建立了光皮樺的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）反應(yīng)體系。簡(jiǎn)單重復(fù)序列[6]（simple sequence repeat，SSR）或者微衛(wèi)星序列[7]（microsatellite，MS），是一類由幾個(gè)到十幾個(gè)核苷酸串聯(lián)重復(fù)組成的DNA序列。其長(zhǎng)度一般在100 bp以下，廣泛分布于生物體基因組的不同位置，由于重復(fù)次數(shù)不同及重復(fù)程度不完全造成的每個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性。微衛(wèi)星序列兩端多是相對(duì)保守的單拷貝序列，因此可以根據(jù)兩端序列設(shè)計(jì)特異引物對(duì)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度多態(tài)性可用作分子標(biāo)記。SSR標(biāo)記具有共顯性、高度重復(fù)性、高度豐富的多態(tài)性等優(yōu)點(diǎn)，成為構(gòu)建遺傳連鎖圖譜[8]，研究群體遺傳學(xué)[9]，進(jìn)行分子標(biāo)記輔助育種[10]，繪制品種指紋圖譜[11]，檢測(cè)品種純度[12]等的理想工具。SSR標(biāo)記的眾多優(yōu)點(diǎn)使它成為最理想的分子標(biāo)記之一。本研究利用近緣種的引物在光皮樺中進(jìn)行擴(kuò)增，建立光皮樺的SSR反應(yīng)體系，為應(yīng)用SSR分子標(biāo)記對(duì)光皮樺群體進(jìn)行研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

光皮樺材料來(lái)自浙江林學(xué)院智能溫室，取正常生長(zhǎng)的嫩葉，置－70℃冰柜保存?zhèn)溆?。Taq DNA聚合酶（83.35 mkat·L－1），脫氧核糖核苷酸 dNTPs（各 2.5 mol·L－1），氯化鎂 MgCl2（25.0 mol·L－1）等試劑均購(gòu)于由寶生物工程（大連）有限公司，引物由GenScript公司合成。

1.2 方法

1.2.1 光皮樺DNA的提取和檢測(cè) 本研究采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）-硅珠吸附法提取光皮樺葉片DNA，用NanoDrop微量分光光度計(jì)（ND-1000）測(cè)定DNA的純度和濃度。同時(shí)每個(gè)樣品取5 μL，加1 μL上樣緩沖液混合后，于10.00 g·L－1瓊脂糖凝膠（含 0.05 g·L－1溴化乙錠）進(jìn)行電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)（Gel DocTM，Bio-Rad）下觀察并拍照。將樣品稀釋至20.0 mg·L－1，置于-20℃下保存。

1.2.2 PCR擴(kuò)增及其產(chǎn)物檢測(cè) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增在ABI 9700 PCR儀上進(jìn)行。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃，2 min；94℃，30 s；51～60℃（各引物退火溫度不同），30 s；72℃，30 s（30個(gè)循環(huán)）；72℃，5 min。反應(yīng)總體積為20 μL。體系建立過(guò)程中，分別對(duì)Mg2+濃度、dNTPs濃度、Taq DNA聚合酶濃度、引物濃度和模板DNA用量等設(shè)置不同的濃度梯度，以確定最佳反應(yīng)體系。

PCR產(chǎn)物經(jīng)15.00 g·L－1瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)（Gel DocTM，Bio-Rad）上觀察、拍照和分析。

1.2.3 PCR反應(yīng)因素水平的確定為了確定PCR反應(yīng)中5個(gè)因素（模板DNA用量、dNTPs濃度、Mg2+濃度、引物濃度、Taq DNA聚合酶濃度）的水平，選用引物AB084473采用單因素法進(jìn)行試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次）。PCR反應(yīng)的因素水平見表1。

1.2.4 引物合成 SSR引物的序列來(lái)源于近緣種日本白樺Betula platyphylla var.japonica[13]和歐洲白樺 B.pendula[14]的 36 對(duì) SSR 引物。

1.2.5 電泳檢測(cè) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在80 g·L－1聚丙烯酰胺凝膠上電泳檢測(cè)，染色方法參照胥猛[15]等的方法，功率恒為75 W，電泳1.0～1.5 h。

表1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的因素水平Table1 Factors and levels of PCR

1.2.6 引物通用性研究 隨機(jī)選取引物AF310851，AB084479，AB084480（GenBank accession number），PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在80.00 g·L－1聚丙烯酰胺凝膠上電泳，參照李明芳[16]的方法，割取多態(tài)性片段，進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增后在瓊脂糖上電泳檢測(cè)，用試劑盒回收擴(kuò)增產(chǎn)物，4℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)入大腸桿菌Escherichia coli培養(yǎng)12 h以上，如藍(lán)白斑區(qū)別不明顯，4℃放置1 h，挑單克隆，培養(yǎng)8 h進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)，測(cè)序。

2 結(jié)果和分析

2.1 不同DNA用量對(duì)SSR反應(yīng)結(jié)果的影響

當(dāng)其他條件一定 （0.200 mmol·L－1dNTPs，1.50 mmol·L－1Mg2+，2.50 mmol·L－1引物，1 × 16.67 nkat Taq酶），由圖1可知，模板DNA用量為20或40 ng時(shí)，擴(kuò)增出的條帶較弱；而用量為60或80 ng時(shí)，有較好的結(jié)果；當(dāng)用量為100 ng時(shí)，擴(kuò)增條帶反而變?nèi)?，可能是模板DNA濃度較大，影響反應(yīng)體系濃度，進(jìn)而影響PCR反應(yīng)等因素造成的。為了節(jié)約試劑和減少非特異性條帶的產(chǎn)生，所以本實(shí)驗(yàn)選用的模板DNA用量為60 ng。

2.2 不同dNTPs濃度對(duì)結(jié)果的影響

當(dāng)其他條件一定（模板 DNA 用量為 60 ng，1.50 mmol·L－1Mg2+，2.50 mmol·L－1引物，1 × 16.67 nkat Taq酶），6個(gè)dNTPs濃度均可擴(kuò)增出條帶。圖2顯示，當(dāng)dNTPs濃度為0.125 mmol·L－1時(shí)，擴(kuò)增出的條帶較弱；而dNTPs濃度為0.200，0.175，0.150 mmol·L－1時(shí)，有較好的結(jié)果；當(dāng)濃度為0.250和0.225 mmol·L－1時(shí)，擴(kuò)增條帶反而變?nèi)酰赡苁菙U(kuò)增的片段較小，當(dāng)dNTPs濃度增大時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物不隨之增加造成的。體系選用0.175 mmol·L－1為dNTPs最終濃度。

2.3 不同Mg2+濃度對(duì)結(jié)果的影響

當(dāng)其他條件一定（模板 DNA 用量為 60 ng，0.175 mmol·L－1dNTPs，2.50 mmol·L－1引物，1 × 16.67 nkat Taq酶），Mg2+濃度對(duì)PCR反應(yīng)有很大影響，Mg2+濃度過(guò)高容易引起非特異性擴(kuò)增，導(dǎo)致陽(yáng)性克隆較多，影響數(shù)據(jù)分析結(jié)果。當(dāng)Mg2+濃度為1.00和1.25 mmol·L－1時(shí)，擴(kuò)增條帶很弱；而Mg2+濃度為1.50 mmol·L－1時(shí)，有較好的結(jié)果；當(dāng)濃度為1.75 mmol·L－1時(shí)，擴(kuò)增主條帶反而變?nèi)?；?dāng)Mg2+濃度為2.00和2.25 mmol·L－1時(shí)，主條帶亮度又增強(qiáng)，可能此時(shí)已經(jīng)在進(jìn)行非特異片段的擴(kuò)增（圖3）。所以選用 Mg2+最終濃度為 1.50 mmol·L－1。

2.4 不同引物濃度對(duì)結(jié)果的影響

當(dāng)其他條件一定（模板 DNA 用量為 60 ng，0.175 mmol·L－1dNTPs，1.50 mmol·L－1Mg2+，1 × 16.67 nkat Taq酶），引物濃度為1.00，1.50，2.00 mmol·L－1時(shí)，擴(kuò)增的條帶極其微弱，幾乎檢測(cè)不到；當(dāng)引物濃度增加到 2.50和 3.00 mmol·L－1時(shí)，條帶亮度增高（圖 4）。所以選用 2.50 mmol·L－1為最終濃度。

圖1 DNA用量對(duì)SSR反應(yīng)結(jié)果的影響Figure1 Effects of DNA dosages on result of SSR reaction

圖2 不同dNTPs濃度對(duì)SSR反應(yīng)結(jié)果的影響Figure2 Effects of different dNTPs concentrations on result of SSR reaction

圖3 不同Mg2+濃度對(duì)SSR反應(yīng)結(jié)果的影響Figure3 Effects of different Mg2+concentrations on result of SSR reaction

圖4 不同引物濃度對(duì)SSR反應(yīng)結(jié)果的影響Figure4 Effects of different primers concentrations on result of SSR reaction

圖5 不同酶用量對(duì)SSR反應(yīng)結(jié)果的影響Figure5 Effects of different enzyme dosages on result of SSR reaction

2.5 不同酶用量對(duì)結(jié)果的影響

當(dāng)其他條件一定（模板 DNA 用量為 60 ng，0.175 mmol·L－1dNTPs，1.50 mmol·L－1Mg2+，2.50 mmol·L－1引物），Taq DNA聚合酶用量是PCR反應(yīng)中最為重要的影響因子之一。Taq DNA聚合酶濃度高時(shí)，極易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增。如圖5所示，5個(gè)處理均有擴(kuò)增產(chǎn)物，但當(dāng)Taq DNA聚合酶濃度為0.5×16.67 nkat時(shí)，擴(kuò)增條帶很弱；濃度0.8×16.67，1.0×16.67，1.5×16.67 nkat時(shí)，譜帶亮且清晰；2.0×16.67時(shí)，條帶反而變?nèi)酢Ｒ虼?，確定Taq DNA聚合酶適宜用量為16.67 nkat。

2.6 退火溫度的影響

退火溫度的高低與PCR擴(kuò)增特異性有顯著的相關(guān)性，而退火溫度主要取決于引物的解鏈溫度（melting temperature，Tm）值、引物與模板的配對(duì)程度等因素。當(dāng)溫度較低時(shí)，非特異性條帶增加，退火溫度較高時(shí)，條帶變少（圖6）。所以體系選用的退火溫度比在日本白樺（其引物退火溫度為56℃）中提高了1℃。

2.7 歐洲白樺和日本白樺引物通用性檢驗(yàn)

圖6 部分引物的在不同退火溫度下擴(kuò)增產(chǎn)物在80 g·L－1聚丙烯酰胺凝膠上電泳檢測(cè)圖Figure6 Amplified product of some pairs of primer at different annealing temperature detecting in 80 g·L－1PAGE

表2 引物AF310851，AB084479，AB084480序列在GeneBank比對(duì)結(jié)果Table2 Blast results of AF310851，AB084479，AB084480 in GeneBank

圖7 引物AB084473擴(kuò)增產(chǎn)物在80 g·L－1聚丙烯酰胺凝膠上電泳檢測(cè)圖Figure7 Amplified product of AB084473 detecting in 80 g·L－1PAGE

克隆序列經(jīng)比對(duì)后，與原物種序列相似度（max ident值）都在95%以上（表2），說(shuō)明歐洲白樺和日本白樺的引物可以應(yīng)用于光皮樺。體系建立后用引物AB084473對(duì)光皮樺16個(gè)植株的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，得到較好的擴(kuò)增結(jié)果（圖7）。

3 結(jié)論與討論

通過(guò)單因素法確定了光皮樺SSR反應(yīng)體系中模板DNA用量、Mg2+濃度、dNTPs濃度、引物濃度、Taq DNA聚合酶濃度，建立光皮樺SSR反應(yīng)體系。在體系建立過(guò)程中，當(dāng)各個(gè)因素水平較低或較高時(shí)，條帶都比較弱，這與柳曉磊等[17]對(duì)椰子Cocos nucifera的研究結(jié)果一致。其中退火溫度是影響PCR反應(yīng)的重要因素之一，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：較小的溫度變化對(duì)最后的擴(kuò)增結(jié)果影響不明顯，但較大的溫度跨度，影響擴(kuò)增條帶的多寡及其清晰程度。所選的SSR引物各解鏈溫度值相差很大，最大跨度達(dá)10℃，特別需要對(duì)每一對(duì)引物進(jìn)行梯度退火實(shí)驗(yàn)，以期得到各引物最佳退火溫度。

SSR分子標(biāo)記因具有諸多優(yōu)點(diǎn)，成為現(xiàn)代分子生物學(xué)最理想的標(biāo)記之一，但其昂貴的引物開發(fā)費(fèi)用，令人望而卻步。而微衛(wèi)星序列的又具有保守性，使其引物在近緣中可以通用。同時(shí)在植物分類學(xué)上，光皮樺、日本白樺和歐洲白樺同屬于樺木科樺木屬，親緣關(guān)系較近，微衛(wèi)星序列也趨于一致，故日本白樺和歐洲白樺的SSR引物在光皮樺中應(yīng)具有較高通用性。本研究結(jié)果也表明：3個(gè)隨機(jī)選取的SSR引物在光皮樺中的擴(kuò)增序列，與原物種白樺的擴(kuò)增序列經(jīng)比對(duì)，最大相似度值均達(dá)到95.0%以上。

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