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青藤堿對MsPGN大鼠腎臟病理及TNF-a表達(dá)的影響

2010-05-26 06:14陳志強(qiáng)范煥芳閆翠環(huán)
中成藥 2010年5期
關(guān)鍵詞:青藤系膜雷公藤

方 敬, 陳志強(qiáng), 范煥芳, 閆翠環(huán)

(河北醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究所,河北石家莊 050017)

系膜增生性腎小球腎炎(MsPGN)是一種免疫介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)性疾病,是指以腎小球系膜細(xì)胞增生和細(xì)胞基質(zhì)積聚為主要病理改變的一類腎小球疾?。?],近幾年國內(nèi)有報(bào)道,青藤堿可以減輕腎小球炎癥反應(yīng)的作用,并且副作用小,沒有肝損害。本實(shí)驗(yàn)旨在通過觀察青藤堿對MsPGN大鼠腎臟病理形態(tài)學(xué)及腫瘤壞死因子-a(TNF-a)表達(dá)的影響,探討青藤堿在MsPGN病理過程中的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物 成年♂SD大鼠,體重(130±170)g,共40只,由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供,合格證號:冀醫(yī)動管字第04057。

1.2 試劑 兔抗大鼠TNF-a多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司);SP(二抗為羊抗兔)試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司)。TNF-a引物上游:5’-GTC GTA GCA AAC CAC CAA G-3’,下游 5’-GTC GTA GCA AAC CAC CAA G-3’,(北京賽百盛工程技術(shù)服務(wù)有限公司)。

1.3 模型制備 動物隨機(jī)分為4組,每組10只,分別為正常組、模型組、青藤堿組、雷公藤多苷組,采用改良的慢性血清病性MsPGN模型,10%的水合氯醛麻醉后,經(jīng)背部切除左側(cè)腎臟,在每只大鼠背部皮下分點(diǎn)注射完全弗氏佐劑0.1 mL加BSA 3 mg,于第1、2周末背部皮下注射不完全弗氏佐劑0.1 mL加BSA 3 mg,3周后腹腔注射BSA連續(xù)4次,每次間隔 1 h,注射劑量每只分別為0.5、1、1.5、3.0 mg,次日每只腹腔注射BSA 2 mg。第4周正式免疫:尾靜脈與腹腔注射隔日進(jìn)行,每只大鼠尾靜脈注射BSA劑量從0.5 mg開始,每次增加0.5 mg,至2.5 mg為止,繼續(xù)每周加量0.5 mg,至每日用量5 mg為止,腹腔注射量是尾靜脈注射量的1倍,至每日用量10 mg為止,免疫兩周后尾靜脈注射大腸桿菌內(nèi)毒素(LPS)100 μg/只,全部大鼠于正式免疫8周后處死取腎組織。

1.4 實(shí)驗(yàn)用藥及方法 采用直接灌胃方法,于實(shí)驗(yàn)第4周開始灌胃給藥,每日1次,青藤堿組采用正清風(fēng)痛寧(白云山正清制藥股份有限公司 批號:9911105),服藥量為30 mg/(kg·d),按成人/(kg·d)劑量的15倍給藥;雷公藤多苷(TWP)組采用雷公藤多苷片(湖南省株洲市制藥三廠 批號:Z43020138)服藥量為20 mg/(kg·d),按成人/(kg·d)劑量的15倍給藥,正常組灌以相應(yīng)量的自來水。各組灌胃共4周。

1.5 腎組織標(biāo)本制作及觀察

1.5.1 光鏡 實(shí)驗(yàn)第8周末,無菌下取右腎組織,HE、PAS染色,鏡下觀察并拍片。

1.5.2 免疫組織化學(xué)染色 采用SP法觀察腎小球中TNF-a的變化,并進(jìn)行半定量分析。腎小球內(nèi)表達(dá):采用HMIAS-2000型高清晰度彩色病理圖象分析系統(tǒng),每組選取6只大鼠標(biāo)本,每個標(biāo)本測量10個完整腎小球進(jìn)行半定量分析。腎小管的表達(dá):選用標(biāo)本數(shù)及分析系統(tǒng)同上。檢測每張切片10個視野,計(jì)算每個視野陽性染色面積以及顯示屏面積,陽性染色面積和顯示屏面積的比值表示相對含量。

1.5.3 逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR) 引物的設(shè)計(jì)與合成:TNF-α、內(nèi)參照β-actin的引物設(shè)計(jì)用PrimerPremier5.0引物設(shè)計(jì)軟件自行設(shè)計(jì)完成,由北京賽百盛生物工程公司鑒定并合成。TNF-α的上下游引物序列分別為5’-GTC GTA GCA AAC CAC CAA G-3’,5’-GTC GTA GCA AAC CAC CAA G-3’,擴(kuò)增的基因片段長度為214 bp。混勻,8 000 r/min離心30 s。PCR儀目的基因和內(nèi)參照同管擴(kuò)增,反應(yīng)條件:以95 ℃預(yù)變性10 min,95 ℃35 s,54 ℃退火35 s,72 ℃35 s,30循環(huán),72℃延伸10 min。各組 PCR產(chǎn)物20 μl,gold view染色,2%瓊脂糖凝膠電泳,經(jīng)凝膠圖像定量分析系統(tǒng)成像,以β-actin為內(nèi)參照,應(yīng)用讀膠儀讀取各條產(chǎn)物帶的光密度值,并計(jì)算產(chǎn)物的相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS11.5 for windows統(tǒng)計(jì)軟件,所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用單因素方差分析法對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 光鏡觀察結(jié)果 正常組腎小球結(jié)構(gòu)正常,腎小球毛細(xì)血管腔開放,系膜區(qū)的寬度小于血管直徑,腎小管、間質(zhì)無異常。模型組腎小球系膜區(qū)明顯增寬,系膜基質(zhì)增多,腎小球毛細(xì)血管腔受壓變窄或閉塞。部分腎小管上皮細(xì)胞腫脹、管腔狹窄,間質(zhì)有炎細(xì)胞浸潤。青藤堿組和雷公藤多苷組腎小球系膜區(qū)的寬度明顯小于模型組,其寬度等于或小于毛細(xì)血管腔直徑,腎小球毛細(xì)血管腔呈開放狀態(tài)。

2.2 免疫組化檢驗(yàn)結(jié)果(表1) 正常組腎組織中腎小管僅呈微弱陽性反應(yīng),腎小球呈陰性反應(yīng);模型組在腎小球及腎小管中分布的范圍和強(qiáng)度明顯擴(kuò)大和增強(qiáng);青藤堿組表達(dá)明顯降低(與模型組P<0.01),兩治療組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)

表1 免疫組化檢驗(yàn)結(jié)果(±s)

表1 免疫組化檢驗(yàn)結(jié)果(±s)

與模型組比較,##P<0.01。

組別 樣本數(shù)/個 腎小球 腎小管正常對照組模型組青藤堿組雷公藤多苷組6666 1.09±0.27 10.03±2.99 4.52±0.64##4.68±0.55##1.11±0.50 12.11±3.76 5.74±1.38##5.32±1.11##

2.3 RT-PCR結(jié)果(表2) 各組腎組織的TNF-αmRNA PCR產(chǎn)物電泳條帶則顯示不均一。正常組有基礎(chǔ)水平的TNF-αmRNA表達(dá)。提示MsPGN大鼠TNF-αmRNA表達(dá)存在明顯的上調(diào)。青藤堿組和雷公藤多苷組TNF-αmRNA表達(dá)明顯下調(diào)(與模型組P<0.01),提示青藤堿可以抑制腎組織TNF-αmRNA的表達(dá)。兩治療組相比無顯著差異(P>0.05)

表2 腎組織TNF-αmRNA的表達(dá)(±s)

表2 腎組織TNF-αmRNA的表達(dá)(±s)

與模型組比較,#P<0.05 ##P<0.01。

組別 樣本數(shù)/個 TNF-α 0.32±0.02模型組 6 0.81±0.02青藤堿組 6 0.77±0.03#雷公藤多苷組 6 0.76±0.04 mRNA/%正常對照組6##

3 討論

我們選用鄒氏造模法并進(jìn)行改良制備MsPGN模型[2],實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,青藤堿可以抑制腎小球系膜細(xì)胞增殖,系膜基質(zhì)積聚,延緩病變進(jìn)展,其作用機(jī)制可能與該藥抑制TNF-a的表達(dá)有關(guān)。

TNF-a可以通過多種途徑作用于系膜細(xì)胞。首先TNF-a促進(jìn)系膜細(xì)胞主要組織相容性抗原Ⅰ和Ⅱ表達(dá),促進(jìn)5’-核苷酸、促凝血物質(zhì),糖蛋白合成;TNF-a與IL-1協(xié)同作用在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平刺激系膜細(xì)胞合成前列腺素和花生四烯酸,增強(qiáng)磷脂酶A活性,增強(qiáng)環(huán)氧化酶活性,使MC增殖、基質(zhì)增寬[3];而且 TNF-a誘導(dǎo)系膜細(xì)胞產(chǎn)生血小板活化因子(PAF)[4],影響腎臟血液循環(huán)的同時,也可改變腎小球系膜細(xì)胞的功能,使其發(fā)生細(xì)胞收縮,導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞骨架改變,刺激系膜細(xì)胞分裂增殖。此外,TNF-a本身的毒性作用可以造成系膜細(xì)胞變性及壞死性改變。

綜上所述,青藤堿通過下調(diào)TNF-a及TNF-amRNA的表達(dá),從多種途徑作用于系膜細(xì)胞,改善MsPGN大鼠腎臟病理改變,延緩腎小球硬化。

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