柴銀感冒顆?？共《咀饔玫难芯?/h1>
2010-05-26 06:14崔曉蘭王歆君
中成藥 2010年5期
黃 華， 崔曉蘭， 王歆君， 姚 華
（1.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，新疆烏魯木齊 830004;2.中國中醫(yī)科學院中藥研究所，北京 100700;3.新疆制藥廠，新疆烏魯木齊 830032）
柴銀感冒顆粒（無糖型）為衛(wèi)生部部頒標準收載品種，是由柴胡、金銀花、大青葉、板藍根、陳皮、甘草等藥材組成的復方制劑，具有清熱解毒等功效，臨床主要用于風熱感冒。本文通過體內、外實驗，對柴銀感冒顆粒的抗病毒作用展開研究，為其在臨床防治流感的應用提供參考。
1 實驗材料
受試藥 柴銀感冒顆粒（無糖型），15 g/袋，臨床成人口服 1～2袋/次，3次/日，國藥準字Z20025872，由新疆制藥廠提供，批號20040556;抗病毒顆粒，15 g/袋，臨床成人口服1～2袋/次，3次/日，國藥準字Z51020073，四川光大制藥有限公司生產，批號0406027。
病毒及細胞株 甲型流感病毒（A）、乙型流感病毒（B）、柯薩奇B族病毒5型（Cox B5）、副流感病毒1型（HVJ－1）、呼吸道合胞病毒（RSV）、腺病毒3型（Ad－3），流感病毒亞甲型鼠肺適應株（FM1），分別購自中國預防醫(yī)科院病毒研究所及兒科研究所。狗腎傳代細胞株（MDCK），購自中國預防醫(yī)學科學院病毒研究所。
實驗動物 昆明種小鼠，♀♂各半，體重（14±1）g，由北京維通利華實驗動物技術研究所提供，合格證 scxk（京）2002－003 號。
細胞營養(yǎng)液 培養(yǎng)液含5%小牛血清、維持液含2%小牛血清。
試劑與儀器 含谷氨酰胺的MEM培養(yǎng)基（美國GIBICOL公司）;DMSO、HEPES、小牛血清（中國醫(yī)科院生物醫(yī)學工程研究所）;L－谷氨酰胺（Sigma公司）;MTT、胰蛋白酶（Amresco公司）。
BHC－1300ⅡA/B3型生物安全柜（蘇凈集團）;HH.CP－01 型 CO2培養(yǎng)箱（上海福瑪）;XDS－1B 倒置顯微鏡（南京翼飛）;MDF－382E型超低溫冰箱（日本SANYO電器）;SZ－96自動純水蒸餾器（上海亞榮）;DM LB/11888010型熒光顯微鏡（德國Leica）。
2 方法與結果［3，4］
2.1 體外實驗
柴銀感冒顆粒和抗病毒顆粒均以純水配成100 mg/mL的原液，過濾除菌后備用，實驗時按需要做倍比稀釋。
2.1.1 測定藥物對MDCK細胞的毒性
分別將原藥液用維持液稀釋成1∶4、1∶8、1∶16、…、1∶256共七個濃度，加到接種MDCK細胞并已長成單層的96孔培養(yǎng)板中，100 μL/孔，每稀釋度4個復孔，同時設細胞對照。將培養(yǎng)板置37°C 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察細胞生長情況，確定細胞不出現(xiàn)明顯退變的最低稀釋倍數(shù)為最大無毒濃度（TC0），并按 Reed－Muench法計算 50%毒性濃度（TC50），結果見表1。
表1 對MDCK細胞的TC0和TC50的測定
2.1.2 對病毒致細胞病變（CPE）的影響
取已接種MDCK細胞并長成單層的培養(yǎng)板，吸棄培養(yǎng)液，按100倍的半數(shù)組織感染劑量（TCID50）分別加入不同病毒液50 μL，置37°C 5%CO2培養(yǎng)箱中吸附1 h后，吸棄病毒液，用不含小牛血清的Eagle’s維持液洗細胞表面2次，設細胞對照組、病毒對照組、抗病毒顆粒組和柴銀顆粒不同濃度（取TC0及其以下的3個2倍稀釋度共4個濃度）的給藥組，4孔/組。給藥組加入不同稀釋度的藥液，對照組加維持液，100 μL/孔。培養(yǎng)板置 37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日倒置顯微鏡下觀察細胞病變情況，其程度按六級標準判斷，并按Reed－Muench法計算IC50和SI（TC50/IC50）。
－:細胞生長正常，無病變出現(xiàn);
±:細胞病變少于整個單層細胞的10%;
1:細胞病變約占整個單層細胞的10% ～25%;
2:細胞病變約占整個單層細胞的25% ～50%以下;
3:細胞病變約占整個單層細胞的50% ～75%以下;
4:細胞病變約占整個單層細胞的75%以上。
結果柴銀感冒顆粒對甲、乙型流感病毒、HVJ－1、Cox B5、RSV有明顯的抑制作用，其 IC50分別為457.0、676.1、347.2、537.0、562.4 μg/mL，SI分別為9.8、6.6、12.8、8.3、7.9，對 Ad－3 無明顯抑制作用（表2、3）。
表2 對病毒致MDCK細胞病變程度（CPE）的影響
2.2 體內實驗
2.2.1 對小鼠流感病毒性肺炎的抑制作用
表3 對病毒致MDCK細胞病變的IC50和SI
取小鼠60只，隨機分為正常對照組、病毒感染對照組、抗病毒顆粒組和3個劑量的柴銀感冒顆粒組，每組10只。除正常對照組外，將小鼠用乙醚輕度麻醉后以15LD50的FM1滴鼻感染，0.05 mL/只。感染前一天開始按劑量灌胃給藥，每天1次，連續(xù)5 d，對照組給予等量蒸餾水（DW）灌胃。第6天各組小鼠稱重后處死解剖，摘取全肺稱重，計算肺指數(shù)和肺指數(shù)抑制率。
結果3個劑量的柴銀感冒顆粒肺指數(shù)值均低于病毒感染對照組，其中大劑量組對FM1引起的肺炎有明顯的抑制作用（表4）。
表4 對小鼠流感病毒性肺炎的抑制作用（±s）
表4 對小鼠流感病毒性肺炎的抑制作用（±s）
與正常對照組比較，##P＜0.01;與病毒感染對照組比較，*P＜0.05，**P ＜0.01。
組別 劑量/（g/kg）動物數(shù)/只 肺指數(shù)值 抑制率/%正常對照 — 10 0.98±0.04—27.3病毒感染對照 — 10 1.50±0.34## —抗病毒顆粒 6 10 1.17±0.24* 22.0柴銀感冒顆粒 3 10 1.27±0.40 15.3 6 10 1.25±0.32 16.7 12 10 1.09±0.16**
2.2.2 對流感病毒所致小鼠死亡的保護作用
取小鼠100只，隨機分為病毒感染對照組、抗病毒顆粒組和三個劑量的柴銀感冒顆粒組，每組20只。各給藥組按劑量灌胃給藥，每天1次，連續(xù)7 d，病毒對照組給予等量的蒸餾水。給藥第2天各組小鼠用乙醚輕度麻醉后，F(xiàn)M1病毒液取感染后死亡率超過90%的濃度2LD50滴鼻感染，每只0.05 mL。記錄感染后小鼠的死亡情況，計算死亡保護率及生命延長率。
結果在感染病毒后15 d內，各給藥組小鼠死亡率均低于感染對照組，存活時間較感染組延長，柴銀感冒顆粒中、大劑量保護作用明顯，死亡保護率分別為21.1%、31.6%，生命延長率為17.8%和22.5%（表5）。
表5 對流感病毒致小鼠死亡的保護作用
2.2.3 對小鼠肺內流感病毒增殖量的影響
取小鼠50只，隨機分為病毒感染組、抗病毒顆粒組和3個劑量的柴銀顆粒組，每組10只。各給藥組動物按劑量灌胃給藥，2次/d，連續(xù)3 d。對照組給等量的蒸餾水。于給藥第2天各組動物以1000LD50滴鼻感染 FM1，0.05 mL/只，48 h 后處死動物，摘取左肺中葉固定，常規(guī)脫水、包埋、制作石蠟切片，間接熒光染色，觀察計數(shù)肺內熒光顆粒，判斷藥物對病毒增殖的影響。
結果3個劑量的柴銀顆粒組肺內病毒增殖量均明顯低于病毒對照組，表明柴銀顆粒對小鼠肺內流感病毒的增殖有顯著的抑制作用（表6）。
本實驗研究結果表明，柴銀感冒顆粒體外給藥可抑制甲型、乙型流感病毒、副流感病毒等呼吸病毒所導致的細胞病變;對流感病毒感染小鼠有明顯的保護作用，可降低死亡率并延長小鼠生存期;對小鼠流感病毒性肺炎有明顯的抑制作用，并可抑制小鼠肺內流感病毒的增殖。
表6 柴銀顆粒對小鼠肺內流感病毒增殖量的影響（±s）
表6 柴銀顆粒對小鼠肺內流感病毒增殖量的影響（±s）
與病毒感染對照組比較，**P＜0.01。
組別 劑量/（g/kg） 終樣本數(shù)/動物數(shù)/只 檢查總數(shù)/個 陽性數(shù)/個 陽性率/% 抑制率/%病毒感染對照 —9/10 238 101 41.8±8.5 0抗病毒顆粒 6 9/10 218 50 22.9±6.2** 45.3柴銀感冒顆粒 3 9/10 234 62 30.7±6.4** 26.7 6 9/10 214 60 28.9±9.3** 32.5 12 9/10 228 70 26.2±5.8**37.5
3 討論
傳統(tǒng)中藥在防治流感方面有其獨道之處，許多解表藥、清熱藥和以它們?yōu)橹鹘M方的中成藥可通過抗病毒、免疫調節(jié)、解熱抗炎等途徑起到抗流感作用［1］。如單味藥中，柴胡的水提液及揮發(fā)油對流感病毒有顯著的抑制作用［1，2］;金銀花水提液可抑制流感病毒致細胞病變作用［1，2］，降低流感病毒感染小鼠的死亡率，并降低鼠肺中病毒血凝素的效價［1］;板藍根水提液在體外雞胚試驗中可抑制流感病毒的增殖，并抑制流感病毒致人胚腎原代細胞的病變［1，2］。這些單味藥經過配伍或組成復方后，抗病毒范圍可能互補、擴大甚至協(xié)同［1］。本文對柴銀感冒顆粒的研究證實該復方制劑對流感病毒等多種呼吸道病毒均有良好的抗病毒作用，為其在臨床用于防治病毒性感冒提供了實驗依據(jù)。
［1］李艷華，于康震，佟恒敏，等.中藥抗流感病毒研究概況［J］.中國獸醫(yī)雜志，2003，39（6）:35－37.
［2］馬振亞.中藥抗病毒抗菌作用研究［M］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2005:74，79，91.
［3］陳鴻珊，張興權，陶佩珍，等.抗病毒藥物及其研究方法［M］.北京:化學工業(yè)出版社，2006:6.
［4］黃禎祥，洪 濤，劉崇柏.醫(yī)學病毒學基礎及實驗技術［M］.北京:科學出版社，1990:2.
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表1 對MDCK細胞的TC0和TC50的測定
2.1.2 對病毒致細胞病變（CPE）的影響
取已接種MDCK細胞并長成單層的培養(yǎng)板，吸棄培養(yǎng)液，按100倍的半數(shù)組織感染劑量（TCID50）分別加入不同病毒液50 μL，置37°C 5%CO2培養(yǎng)箱中吸附1 h后，吸棄病毒液，用不含小牛血清的Eagle’s維持液洗細胞表面2次，設細胞對照組、病毒對照組、抗病毒顆粒組和柴銀顆粒不同濃度（取TC0及其以下的3個2倍稀釋度共4個濃度）的給藥組，4孔/組。給藥組加入不同稀釋度的藥液，對照組加維持液，100 μL/孔。培養(yǎng)板置 37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日倒置顯微鏡下觀察細胞病變情況，其程度按六級標準判斷，并按Reed－Muench法計算IC50和SI（TC50/IC50）。
－:細胞生長正常，無病變出現(xiàn);
±:細胞病變少于整個單層細胞的10%;
1:細胞病變約占整個單層細胞的10% ～25%;
2:細胞病變約占整個單層細胞的25% ～50%以下;
3:細胞病變約占整個單層細胞的50% ～75%以下;
4:細胞病變約占整個單層細胞的75%以上。
結果柴銀感冒顆粒對甲、乙型流感病毒、HVJ－1、Cox B5、RSV有明顯的抑制作用，其 IC50分別為457.0、676.1、347.2、537.0、562.4 μg/mL，SI分別為9.8、6.6、12.8、8.3、7.9，對 Ad－3 無明顯抑制作用（表2、3）。
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結果3個劑量的柴銀感冒顆粒肺指數(shù)值均低于病毒感染對照組，其中大劑量組對FM1引起的肺炎有明顯的抑制作用（表4）。
表4 對小鼠流感病毒性肺炎的抑制作用（±s）
表4 對小鼠流感病毒性肺炎的抑制作用（±s）
與正常對照組比較，##P＜0.01;與病毒感染對照組比較，*P＜0.05，**P ＜0.01。
組別 劑量/（g/kg）動物數(shù)/只 肺指數(shù)值 抑制率/%正常對照 — 10 0.98±0.04—27.3病毒感染對照 — 10 1.50±0.34## —抗病毒顆粒 6 10 1.17±0.24* 22.0柴銀感冒顆粒 3 10 1.27±0.40 15.3 6 10 1.25±0.32 16.7 12 10 1.09±0.16**
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結果在感染病毒后15 d內，各給藥組小鼠死亡率均低于感染對照組，存活時間較感染組延長，柴銀感冒顆粒中、大劑量保護作用明顯，死亡保護率分別為21.1%、31.6%，生命延長率為17.8%和22.5%（表5）。
表5 對流感病毒致小鼠死亡的保護作用
2.2.3 對小鼠肺內流感病毒增殖量的影響
取小鼠50只，隨機分為病毒感染組、抗病毒顆粒組和3個劑量的柴銀顆粒組，每組10只。各給藥組動物按劑量灌胃給藥，2次/d，連續(xù)3 d。對照組給等量的蒸餾水。于給藥第2天各組動物以1000LD50滴鼻感染 FM1，0.05 mL/只，48 h 后處死動物，摘取左肺中葉固定，常規(guī)脫水、包埋、制作石蠟切片，間接熒光染色，觀察計數(shù)肺內熒光顆粒，判斷藥物對病毒增殖的影響。
結果3個劑量的柴銀顆粒組肺內病毒增殖量均明顯低于病毒對照組，表明柴銀顆粒對小鼠肺內流感病毒的增殖有顯著的抑制作用（表6）。
本實驗研究結果表明，柴銀感冒顆粒體外給藥可抑制甲型、乙型流感病毒、副流感病毒等呼吸病毒所導致的細胞病變;對流感病毒感染小鼠有明顯的保護作用，可降低死亡率并延長小鼠生存期;對小鼠流感病毒性肺炎有明顯的抑制作用，并可抑制小鼠肺內流感病毒的增殖。
表6 柴銀顆粒對小鼠肺內流感病毒增殖量的影響（±s）
表6 柴銀顆粒對小鼠肺內流感病毒增殖量的影響（±s）
與病毒感染對照組比較，**P＜0.01。
組別 劑量/（g/kg） 終樣本數(shù)/動物數(shù)/只 檢查總數(shù)/個 陽性數(shù)/個 陽性率/% 抑制率/%病毒感染對照 —9/10 238 101 41.8±8.5 0抗病毒顆粒 6 9/10 218 50 22.9±6.2** 45.3柴銀感冒顆粒 3 9/10 234 62 30.7±6.4** 26.7 6 9/10 214 60 28.9±9.3** 32.5 12 9/10 228 70 26.2±5.8**37.5
3 討論
傳統(tǒng)中藥在防治流感方面有其獨道之處，許多解表藥、清熱藥和以它們?yōu)橹鹘M方的中成藥可通過抗病毒、免疫調節(jié)、解熱抗炎等途徑起到抗流感作用［1］。如單味藥中，柴胡的水提液及揮發(fā)油對流感病毒有顯著的抑制作用［1，2］;金銀花水提液可抑制流感病毒致細胞病變作用［1，2］，降低流感病毒感染小鼠的死亡率，并降低鼠肺中病毒血凝素的效價［1］;板藍根水提液在體外雞胚試驗中可抑制流感病毒的增殖，并抑制流感病毒致人胚腎原代細胞的病變［1，2］。這些單味藥經過配伍或組成復方后，抗病毒范圍可能互補、擴大甚至協(xié)同［1］。本文對柴銀感冒顆粒的研究證實該復方制劑對流感病毒等多種呼吸道病毒均有良好的抗病毒作用，為其在臨床用于防治病毒性感冒提供了實驗依據(jù)。
［1］李艷華，于康震，佟恒敏，等.中藥抗流感病毒研究概況［J］.中國獸醫(yī)雜志，2003，39（6）:35－37.
［2］馬振亞.中藥抗病毒抗菌作用研究［M］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2005:74，79，91.
［3］陳鴻珊，張興權，陶佩珍，等.抗病毒藥物及其研究方法［M］.北京:化學工業(yè)出版社，2006:6.
［4］黃禎祥，洪 濤，劉崇柏.醫(yī)學病毒學基礎及實驗技術［M］.北京:科學出版社，1990:2.
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