陳 浩， 師 亮， 王素云， 楊敬慈， 潘 崚*

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院血液科，石家莊 050000;2.山西醫(yī)科大學(xué)組胚教研室，太原 030001）

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是骨髓內(nèi)漿細(xì)胞異常增生的一種血液系統(tǒng)惡性腫瘤，目前尚缺乏有效治療手段，故尋找新的治療方法尤為必要［1］。β－欖香烯（β-elemene）是具有抗腫瘤功效的中藥溫莪術(shù)的有效提取物［2］。但對(duì)骨髓瘤影響如何，目前尚不清楚。本研究采用不同濃度β－欖香烯處理體外培養(yǎng)的人骨髓瘤RPMI－8226細(xì)胞，觀察β－欖香烯對(duì)骨髓瘤細(xì)胞增殖、周期、凋亡等影響，以期為欖香烯用于對(duì)骨髓瘤的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人骨髓瘤RPMI－8226細(xì)胞由河北醫(yī)科大學(xué)生物科技總公司提供。在含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、鏈霉素 120 μg/mL 的 RPMI－1640中37℃、5%CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，生長(zhǎng)曲線測(cè)試倍增時(shí)間為（24±1）h，1～2 d傳代1次。所有實(shí)驗(yàn)均在細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行。

1.2 藥品與試劑 β－欖香烯購(gòu)自大連金港制藥有限公司，使用前溶于磷酸鹽緩沖液（PBS）中，配成1 000 μmol/L母液，超濾除菌，－20℃保存。碘化丙啶（PI）、噻唑藍(lán)（MTT）購(gòu)自 Sigma公司。Annexin V/PI雙染試劑盒購(gòu)于南京凱基生物公司。Hoechst33342/PI雙染試劑盒購(gòu)于河北渤海生物公司。

1.3 細(xì)胞增殖 采用MTT法檢測(cè)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RPMI－8226細(xì)胞（2×105/mL）接種于96孔板，每孔 200 μL。加入終濃度分別為 10、20、40、80 μmol/L的 β－欖香烯處理，對(duì)照組加入等體積的DMSO，每組各設(shè)4個(gè)平行孔;分別于藥物作用后24、48 和72 h 時(shí)，每孔加入5 g/L MTT 20 μL，繼續(xù)孵育4 h，離心去除上清后各加入DMSO 200 μL，輕微振蕩使結(jié)晶溶解后，以酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度（A）值，計(jì)算增殖抑制率。

增殖抑制率=（1－實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值）×100%

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡 按Annexin V－異硫氰酸熒光素（FITC）試劑盒操作流程，不同濃度β－欖香烯作用48 h后收集細(xì)胞，PBS充分洗滌，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL。取400 μL細(xì)胞懸液，加入5 μL 的 Annexin V－FITC，混勻，室溫避光孵育10 min，離心去上清，重懸細(xì)胞后加入 PI使其終濃度為1 μg/mL，避光作用后上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞周期（FACScaliber，美國(guó)BD公司）。同法，另取細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.5 Hoechst33342/PI雙染熒光顯微鏡觀察 不同濃度β－欖香烯作用48 h后收集細(xì)胞，PBS充分洗滌。1 000 r/min離心棄上清，1 mL培養(yǎng)液重懸，避光加入 10 μL Hoechst 33342，混勻，37℃ 孵育 8 min，PBS沖洗3次去除Hoechst33342，再加入終濃度為5 μg/mL PI染液，避光染色5 min，轉(zhuǎn)移至載玻片，熒光顯微鏡下分別于350 nm及488 nm激發(fā)熒光，200倍鏡下觀察（正常細(xì)胞細(xì)胞核為暗藍(lán)色;早期凋亡細(xì)胞細(xì)胞核呈亮藍(lán)色;中期、晚期凋亡細(xì)胞細(xì)胞核呈淡紅色或深紅色;）。

2 結(jié)果

2.1 β－欖香烯對(duì)骨髓瘤RPMI－8226細(xì)胞體外生長(zhǎng)的影響 β－欖香烯隨著濃度增加和作用時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞增殖抑制作用增強(qiáng)，呈濃度、時(shí)間依賴性;（表1）。

表1 β-欖香烯對(duì)骨髓瘤RPMI-8226細(xì)胞增殖的抑制作用（±s，n=4）Tab.1 Inhibitory effect of β-elemene on proliferation of human multiple myeloma cell line（RPMI-8226）

表1 β-欖香烯對(duì)骨髓瘤RPMI-8226細(xì)胞增殖的抑制作用（±s，n=4）Tab.1 Inhibitory effect of β-elemene on proliferation of human multiple myeloma cell line（RPMI-8226）

與0 μmol/L 組比較，P ＜0.01。

β－欖香烯/（μmol/L）24 h吸光度 抑制率/%48 h吸光度 抑制率/%72 h吸光度 抑制率/%0 0.216 7±0.024 1 0.531 5±0.010 4 0.822 2±0.0441.075 6±0.014 6 90.81 10 0.169 5±0.013 9 21.79 0.332±0.006 2 37.54 0.455 8±0.005 7 44.56 20 0.147 2±0.003 1 32.06 0.227±0.013 4 57.33 0.285 1±0.011 8 65.32 40 0.122 6±0.012 1 43.42 0.145 7±0.015 6 72.58 0.133 7±0.014 2 83.74 80 0.102 6±0.002 3 52.64 0.126 8±0.010 4 76.14 0

2.2 β－欖香烯對(duì)骨髓瘤RPMI－8226細(xì)胞周期的影響 數(shù)據(jù)顯示:各藥物處理組G0/G1細(xì)胞比例較對(duì)照組顯著增加;G2/M、S期細(xì)胞比例較對(duì)照組減少（表2）。

2.3 β－欖香烯對(duì)骨髓瘤RPMI－8226細(xì)胞凋亡的影響 隨β－欖香烯濃度的增加，藥物組骨髓瘤細(xì)胞凋亡率遞增（表3）。

表2 β-欖香烯作用48 h后對(duì)骨髓瘤RPMI-8226細(xì)胞周期的影響（±s，n=4）Tab.2 Influence of β-elemene on cell period of human multiple myeloma cell line（RPMI 8226）

表2 β-欖香烯作用48 h后對(duì)骨髓瘤RPMI-8226細(xì)胞周期的影響（±s，n=4）Tab.2 Influence of β-elemene on cell period of human multiple myeloma cell line（RPMI 8226）

與0 μmol/L組比較，*P ＜0.05，**P＜0.01。

β－欖香烯（μmol/L）各期細(xì)胞所占比例G0/G1 S G2/M 0 47.87±5.67 37.72±3.81 14.41±2.26 10 54.68±4.03** 33.96±2.04* 11.36±1.79*20 60.11±5.78** 30.15±2.42* 8.63±1.05**40 65.26±6.36** 27.84±1.89** 4.94±1.32**80 71.33±5.81** 25.21±2.01** 2.46±0.98**

表3 β-欖香烯作用48 h后對(duì)骨髓瘤RPMI-8226細(xì)胞凋亡的影響（ˉx ± s，n=4）Tab.3 Infuence of β-elemene on apoptosis rate of human multiple myolema cell line（RPMI-8226）in 48 h

2.4 Hoechst33342/PI雙染熒光顯微鏡觀察 對(duì)照組鏡下可見(jiàn)大量暗藍(lán)色正常骨髓瘤RPMI－8226細(xì)胞，偶見(jiàn)凋亡細(xì)胞。10、20 μmol/L β－欖香烯處理組鏡下可見(jiàn)典型凋亡細(xì)胞，以早期凋亡細(xì)胞為主，細(xì)胞核呈亮藍(lán)色，染色質(zhì)凝集，或核呈分葉、碎片狀邊集。40、80 μmol/L β－欖香烯處理組鏡下可見(jiàn)大量凋亡細(xì)胞，中期、晚期凋亡細(xì)胞增多，細(xì)胞核呈淡紅色或深紅色，染色質(zhì)片段化凝集呈多個(gè)亮點(diǎn);還可見(jiàn)少量體積增大、核溶解、深紅色或亮紅色的細(xì)胞。

3 討論

β－欖香烯是抗腫瘤中藥溫莪術(shù)的有效提取物［2］。鑒于此，本研究首先通過(guò) MTT實(shí)驗(yàn)觀察β－欖香烯對(duì)骨髓瘤細(xì)胞體外生長(zhǎng)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同濃度β－欖香烯對(duì)骨髓瘤細(xì)胞增殖均有抑制作用，且呈濃度和時(shí)間依賴性。提示β－欖香烯可抑制骨髓瘤細(xì)胞增殖。

本研究結(jié)果還表明β－欖香烯可阻滯骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)周期，激活細(xì)胞凋亡通路，還可能啟動(dòng)細(xì)胞“凋亡”機(jī)制［3］，導(dǎo)致體外培養(yǎng)的骨髓瘤細(xì)胞增殖抑制，有望成為新的骨髓瘤臨床治療藥物。

［1］Dmoszynska A.Diagnosis and the current trends in multiple myeloma therapy［J］.Pol Arch Med Wewn，2008，118:563－6.

［2］Peng X，Zhao Y，Liang X，et al.Assessing the quality of RCTs on the effect of beta－elemene，one ingredient of a Chinese herb，against malignant tumors［J］.Contemp Clin Trials，2006，27:70－82.

［3］Van Cruchten S，Van Den Broeck W.Morphological and biochemical aspects of apoptosis，oncosis and necrosis［J］.Anat Histol Embryol，2002，31:214－23.