王銅浩，楊茂偉，顏培培，初立偉，高志達

（中國醫(yī)科大學 附屬第一醫(yī)院 1.骨科；2.內分泌科，沈陽 110001）

老年癡呆癥，又稱阿爾茨海默癥（Alzheimer’s disease，簡稱AD），是一種神經退行性疾病。目前，在臨床研究中有關AD患者體內細胞因子的研究已有很多報道［1~2］，但其變化規(guī)律以及姜黃素治療劑量對其變化規(guī)律影響的研究尚不多見。APP/PS1轉基因鼠（β淀粉樣蛋白前體蛋白/早老素1）可表達與AD相關的突變基因，是研究AD及其并發(fā)癥有力的動物模型［3］。姜黃素（curcumin）是從姜科植物姜黃中提取的一種酚類物質，具有抗炎、抗氧化、減少小膠質細胞形成、能改善AD病人的認知功能［4］，本實驗以APP/PS1轉基因鼠做為AD模型，通過檢測鼠模型應用姜黃素治療前后腦及血清中的腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）的含量，探討 APP/PS1 轉基因鼠體內細胞因子TNF-α和IL-6的變化規(guī)律以及不同藥量的姜黃素對其變化規(guī)律的影響，為AD防治方面的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

動物：6月齡雌性APP/PS1轉基因小鼠（B6C3-Tg（APPswe，PSEN1dE9）85Dbo/J，購自美國 Jackson Laboratory），經過常規(guī)飼養(yǎng)，傳代后選擇體質量（20±1）g小鼠36只，再從中隨機選取9只小鼠作為模型組，其余27只小鼠隨機分為3組作為用藥組，除常規(guī)飲食外，姜黃素（Sigma公司，純度>96%）按60，160，600 mg·kg-1加入小鼠飼料，自由飲水。6 月齡雌性野生型小鼠（C57bl/6）9只，（20±1）g為對照組。各組小鼠分籠飼養(yǎng)，常規(guī)飲食，室溫23～25℃，12 h間隔照明，定期紫外線消毒與通風。

1.2 方法

1.2.1 取材及標本制備：每組小鼠各取3只分別于9、12、18月齡時處死，無菌取大腦、血漿，大腦勻漿后上清液和血漿離心后的血清于-80℃保存?zhèn)錅y。

1.2.2 檢測方法：分別應用Quick EIATM小鼠TNF-αELISA試劑盒和Quick EIATM小鼠IL-6 ELISA試劑盒（Dakewe biotech Company Limited）檢測各年齡段小鼠腦組織上清液和血清中的細胞因子TNF-α和IL-6表達水平，按照試劑盒要求進行操作，檢測程序和結果計算與判斷基本相同。

1.2.3 結果計算與判斷：（1）所有OD值都應減除空白值后再行計算。（2）以標準品之OD值在半對數紙上作圖，畫出標準曲線。（3）根據樣品值在該線圖上查出相應小鼠TNF-α和IL-6含量。

1.3 統(tǒng)計學分析

使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析檢驗，所有數值以x±s的形式表示，兩樣本均數比較用t檢驗，多樣本均數比較采用ANOVA進行分析，P<0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 結果

應用ELISA技術分別于9、12、18月齡時檢測各組小鼠的腦組織和血清中的細胞因子TNF-α和IL-6表達水平，結果見表1。

表1 姜黃素對APP/PS1轉基因鼠TNF-α、IL-6的影響Tab.1 The effect of curcumin on TNF-αand IL-6 in APP/PS1 transgenic mice

與對照組（野生型小鼠）相比，模型組（APP/PS1轉基因鼠）腦組織和血清中的TNF-α和IL-6于9月齡時開始升高，且IL-6的變化出現(xiàn)統(tǒng)計學差異（P＜0.05）；12月齡差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；18月齡差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），并且轉基因小鼠體內的炎性因子隨著年齡的增長，病情的加重出現(xiàn)上升趨勢，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

與模型組相比，用藥組姜黃素60 mg·kg-1腦組織和血清中的TNF-α和IL-6表達水平降低；姜黃素160 mg·kg-1出現(xiàn)顯著性差異（P<0.05）；姜黃素 600 mg·kg-1差異更加顯著（P<0.01），TNF-α 和 IL-6 的含量接近對照組（P ＞ 0.05）；姜黃素 600 mg·kg-1各年齡段小鼠相比，TNF-α和IL-6含量無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。

3 討論

臨床研究顯示細胞因子在AD的神經病理損傷過程中起重要作用［1］。對AD患者的病歷檢查結果證實，海馬各區(qū)TNF-α呈高表達，并認為它是介導AD腦內炎性病理反應的關鍵性因子，對AD患者的皮質研究發(fā)現(xiàn)，IL-6的腦內表達也顯著增多。因此，若能抑制TNF-α和IL-6的分泌，就可減慢甚至調整這種惡性循環(huán)，從而減少腦神經細胞的死亡或凋亡，而達到防治AD的目的。

大量的研究證據表明姜黃素可以抑制AD患者腦內 β-淀粉樣蛋白（β-amyloid protein，Aβ）的沉積，改善AD患者的免疫功能［5］，更重要的是姜黃素具有抗炎和抗氧化的作用［6］。Yang等［7］研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可通過調節(jié)APP/PS1轉基因小鼠體內的炎性因子而改善其骨微結構，可見炎性因子對AD及其并發(fā)癥有著重要的作用。因此，本實驗以APP/PS1轉基因小鼠做為AD模型，探討了轉基因鼠隨著病情的發(fā)展，體內細胞因子TNF-α和IL-6的變化規(guī)律，以及不同藥量的姜黃素對其變化規(guī)律的影響。

通過對比實驗數據可發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠相比，APP/PS1轉基因鼠腦組織、血清中的TNF-α和IL-6于9月齡時開始升高，12月齡時差異顯著（P<0.05），18月齡時差異更加顯著（P<0.01）。有研究發(fā)現(xiàn)APP/PS1轉基因小鼠在9月齡時開始表達Aβ，并隨著年齡的增加表達升高［8］，由此可見轉基因小鼠體內的TNF-α和IL-6的變化趨勢可能和Aβ的表達密切相關，而Aβ是淀粉樣前體蛋白（APP）基因編碼的產物是，Aβ出現(xiàn)以后一方面可刺激大腦局部的單核巨噬細胞和小膠質細胞產生TNF-α和IL-6［9］，同時由于其血腦屏障局部功能發(fā)生改變，使局部升高TNF-α和IL-6進入體循環(huán)；另一方面Aβ的表達可導致免疫系統(tǒng)功能的改變，與局部的炎性應答相互作用，從而導致了機體細胞因子的升高。因此可間接推測APP/PS1轉基因小鼠體內TNF-α和IL-6的表達升高和APP、PS1基因存在一定的關聯(lián)。

應用姜黃素60 mg·kg-1治療后，APP/PS1轉基因鼠腦組織、血清中TNF-α和IL-6表達水平降低，160 mg·kg-1治療后出現(xiàn)顯著性差異（P<0.05），600 mg·kg-1時差異更加顯著（P<0.01）。可見應用姜黃素劑量600 mg·kg-1時能夠有效的抑制APP/PS1轉基因鼠體內的細胞毒性因子的產生。研究［10］證實姜黃素用藥在150～750 mg·kg-1對治療去勢后小鼠的骨質疏松效果顯著，且無毒副作用。本實驗中姜黃素的最高用藥量為600 mg·kg-1，小鼠估計攝入量為 1.2～12 mg·kg-1，2 000 mg·kg-1是姜黃素毒性臨界值［11］，該值遠遠大于我們的用藥量，因此600 mg·kg-1用藥量對生物體幾乎毒害作用，且較非甾體等其它抗炎藥。姜黃素負面作用更低。所以每組小鼠都不存在死亡率。Baum等［12］研究發(fā)現(xiàn)姜黃素在AD患者腦內可做為螯合劑結合Aβ周圍的鐵、銅離子，從而加速Aβ的降解。在體內研究還發(fā)現(xiàn)姜黃素可抑制氧化應激反應，保護細胞免受Aβ的攻擊。因此姜黃素可通過影響Aβ的表達，抑制APP/PS1轉基因鼠體內的炎性反應，降低TNF-α和IL-6的含量，從而可有效緩解AD的病情。

上述研究提示APP/PS1轉基因小鼠可通過表達突變的APP、PS1基因編碼Aβ，Aβ的形成和發(fā)展導致了轉基因小鼠體內細胞因子TNF-α及IL-6的升高，在闡明轉基因小鼠體內細胞因子變化規(guī)律的同時，探討了不同藥量的姜黃素對其變化規(guī)律的影響，為在人體中進一步研究AD的防治奠定了基礎。

［1］Rosenberg PB.Clinical aspects of inflammation in Alzheimer’s disease［J］.Int Rev Psychiatry，2005，17（6）：503-514.

［2］Mrak RE，GriffinWS.Interleukin-1，neuroinflammation，and Alzheimer’sdisease［J］.Neurobiol Aging，2001，22（6）：903-908.

［3］Janus C，Westaway D.Transgenic mouse models of Alzheimer’s disease［J］.Physiol Behav，2001，73（5）：873-886.

［4］Ng TP，Chiam PC，Lee T，et a1．Curry concumption and cognitive functionin theelderly［J］.Am JEpidemio，2006，164（9）：898-906.

［5］Ono K，Hasegawa K，Naiki H，et al.Curcumin has potent anti-amyloidogenic effectsfor Alzheimer′s beta-amyloid fibrilsin vitro ［J］.J Neurosci Res，2004，75（6）：742-750.

［6］Motterlini R，F(xiàn)oresti R，Bassi R，et al.Curcumin，an antioxidant and anti-inflammatory agent，inducesheme oxygenase-1 and protectsendothelial cells against oxidative stress ［J］.Free Radic Biol Med，2000，28（8）：1303-1312.

［7］Yang MW，Wang TH，Yan PP，et al.Curcumin improves bone microarchitecture and enhances mineral density in APP/PS1 transgenic mice［J］.Phytomedicine，2010，29（9）：789-799.

［8］Liu L，Ikonen S，Heikkinen T，et al.Effects of fimbria-fornix lesion and Amyloid pathology on spatial learning and memory in transgenic APP+PS1 mice［J］.Behav Brain Res，2002，134（1-2）：433-445.

［9］Chong YH，Sung JH，Shin SA，et a1.Effectsof the beta-amyloid and carboxyl-terminal fragment of Alzheimer’s amyloid precursor protein on the production of the tumor necrosis factor-alpha and matrix metallop-roteinase-9 by human monocytic THP-1［J］.Biol Chem，2001，27（19）：23511-23517.

［10］French DL，Muir JM，Webber CE.The ovariectomized，mature rat model of postmenopausal osteoporosis：An assessment of the bone sparingeffectsof curcumin.Phytomedicine，2008，15 （12）：1069-1078.

［11］Lim GP，Chu T，Yang F，et a1.The curry spice curcumin reduces oxidativedamageand amyloid pathology in an Alzheimer transgenic mouse［J］.JNeurosci，2001，21（21）：8370-8377.

［12］Baum L，Ng A.Curcumin interaction with copper and iron suggests one possible mechanism of action in Alzheimer’s disease animal models［J］.JAlzheimers Dis，2004，6（4）：367-377.