府曉丹，于波，李陽，孟亮，姜振環(huán)，楊瀅

（中國醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，沈陽 110001）

病態(tài)竇房結(jié)綜合征所致的心動過緩是臨床上常見的心律失常之一，目前心動過緩的研究多靠動物模型來完成，但具有一定局限性，直接研究細(xì)胞膜離子通道中電流變化對心房肌細(xì)胞自律性的影響最為可靠。本研究旨在探索原代心房肌細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法，為進(jìn)一步深入研究心動過緩與心房肌細(xì)胞的離子通道之間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

動物：1~3 d的SD大鼠20只，雌雄不限，由中國醫(yī)科大學(xué)動物中心提供。

主要試劑和儀器：DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、D-hank液（Hyclone公司），胰酶、Ⅱ型膠原酶（Sigma公司），兔抗肌鈣蛋白I多抗（Santa Cruz公司），F(xiàn)ITC標(biāo)記山羊抗兔IgG（中杉公司），HERAcell 150 CO2孵箱（德國Heraeus公司），Olympus CX41倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司），Grant Ols200恒溫振蕩水浴鍋（英國Grant公司），Sorvall Super T21冷凍高速離心機(jī)（美國Thermo Scientific公司）。

1.2 方法

1.2.1 心房肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)：SD大鼠呈仰臥位固定，消毒胸部皮膚，沿胸骨右緣剪開，迅速取出心臟并置于D-hank液清洗、去血，剪除心室，留心房部分組織，無菌條件下用眼科剪將心房剪成0.5~1 mm3大小的組織塊。在組織塊中加入0.06%胰酶，37℃水浴8 min，隨后吹打、自然沉淀后去除上清液；再加入0.08%Ⅱ型膠原酶，37℃水浴10 min，吹打后自然沉淀，留取上清液，加入含15%小牛血清的DMEM中止消化。重復(fù)加入0.08%Ⅱ型膠原酶的消化步驟2~3次。用200目金屬濾網(wǎng)過濾每次收集的上清液，將過濾后的細(xì)胞懸液離心（1 000 rmp，4℃，5 min）。向離心后的沉淀中加入DMEM高糖培養(yǎng)液（含10%胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗），接種于培養(yǎng)瓶并置培養(yǎng)箱（5%CO2）中37℃培養(yǎng)1 h后，上清液轉(zhuǎn)移到另一個培養(yǎng)瓶再培養(yǎng)1 h后再換新瓶，用2次差速貼壁法去除成纖維細(xì)胞。24 h后換液，并用倒置顯微鏡觀察。

1.2.2 細(xì)胞片標(biāo)本制備及免疫細(xì)胞化學(xué)染色：待細(xì)胞長好后，用4%多聚甲醛固定15 min做免疫熒光。取待用細(xì)胞片PBS洗3次，每次5 min。以5%BSA室溫封閉1 h，一抗兔抗大鼠肌鈣蛋白Ⅰ4℃過夜，PBS洗3次，每次5 min。加二抗山羊抗兔IgG-FITC，室溫1.5 h，PBS洗3次，復(fù)染細(xì)胞核，熒光顯微鏡下觀察并攝片。

2 結(jié)果

2.1 心房肌細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定

培養(yǎng)至第3天，倒置顯微鏡下觀察見培養(yǎng)的心房肌細(xì)胞有多種形態(tài)，以桿狀、梭形、三角形與不規(guī)則形為主（圖1），細(xì)胞生長密度可以達(dá)到瓶底70%左右。多數(shù)細(xì)胞在貼壁后24~48 h開始出現(xiàn)規(guī)律搏動。

2.2 心房肌細(xì)胞的免疫熒光染色鑒定

經(jīng)免疫細(xì)胞熒光鑒定所培養(yǎng)細(xì)胞為心房肌細(xì)胞（圖2），且90%以上細(xì)胞肌鈣蛋白Ⅰ染色陽性。

3 討論

研究細(xì)胞膜離子通道改變與心動過緩的關(guān)系主要將原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞作為體外模型，由于受到取材困難、細(xì)胞數(shù)量少以及分離技術(shù)等限制，目前對新生大鼠原代心房肌細(xì)胞的培養(yǎng)報(bào)道較少。本研究參考Benardeau等［1］的原代心房肌細(xì)胞培養(yǎng)方法并加以改良。利用消化法成功培養(yǎng)出新生大鼠心房肌細(xì)胞，經(jīng)純化、鑒定，可以滿足下一步分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)要求。實(shí)踐中總結(jié)以下幾點(diǎn)。

3.1 新生大鼠鼠齡的選擇

新生大鼠在出生后3 d內(nèi)具有部分增殖能力，成年大鼠心肌細(xì)胞則為終末分化細(xì)胞，不再具有分裂增殖的能力。因此，大鼠出生時(shí)間越短，其心肌細(xì)胞分離成活率越高，越容易貼壁生長［2］。但是大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)，若選擇胎齡過小的胎鼠，其心肌細(xì)胞對于酶的反復(fù)消化耐受較差，故應(yīng)選擇出生后48~72 h的胎鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)效果最佳。

3.2 消化方法的改進(jìn)

單用胰酶或者將胰酶與膠原酶在同一體系中進(jìn)行消化，其時(shí)間不好掌握，易消化過度導(dǎo)致細(xì)胞釋放DNA，與膠原混在一起形成黏液絮狀樣物質(zhì)，使細(xì)胞上清液難以分離和離心，并且因細(xì)胞量大大減少而影響細(xì)胞提取率。而且單用膠原酶成本較高。故本研究采用低濃度胰酶消化1次后再用膠原酶消化，可減少胰酶和膠原酶的用量，縮短消化時(shí)間，降低細(xì)胞受損程度，從而提高細(xì)胞存活率高。

3.3 心房肌細(xì)胞的純化

原代培養(yǎng)的心房肌細(xì)胞中最主要的干擾細(xì)胞為成纖維細(xì)胞，大量成纖維細(xì)胞的存在不僅限制心肌細(xì)胞的活動，而且其分泌物也影響心肌細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理功能［3］。應(yīng)用差速貼壁分離法去除非心肌細(xì)胞，其原理是根據(jù)心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞在培養(yǎng)器皿表面貼壁生長的速度不同而進(jìn)行分離。在1 h時(shí)，絕大多數(shù)的成纖維細(xì)胞貼壁而心肌細(xì)胞尚未貼壁，這種方法操作簡便、對細(xì)胞影響小，按此方法進(jìn)行分離純化，可得到純度達(dá)95%的心肌細(xì)胞［4］。心肌細(xì)胞的純化方法還有化學(xué)試劑抑制法，即利用特定的化學(xué)物質(zhì)（主要是5溴脫氧尿苷）抑制組織生長活躍的成纖維細(xì)胞增殖，但有報(bào)道認(rèn)為其對心肌細(xì)胞有損傷［2，5］。故本研究采取2次差速貼壁1 h分離法，不損傷細(xì)胞的同時(shí)也提高了心肌細(xì)胞的純化度。

綜上，利用低濃度酶消化法原代培養(yǎng)的新生大鼠心房肌細(xì)胞為研究細(xì)胞膜離子通道改變對心動過緩的影響奠定了基礎(chǔ)。

［1］Benardeau A，Hatem SN，Rucker-Martin C，et a1.Primary culture of human atrial myocytesis associated with the appearanceof structural and functional characteristicsof immaturemyocardium［J］.JMol CelI Cardiol，1997，29（5）：1307.

［2］王志勇，周立，郭義威，等.乳鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng)改進(jìn)［J］.醫(yī)學(xué)信息內(nèi)外科版，2009，3（22）：240-241.

［3］Miragoli M，Gaudesius G，Rohr S.Electrotonic modulation of cardiac impulseconductionbymyofibroblasts［J］.Circ Res，2006，98（6）：801-810.

［4］汪長華.心肌細(xì)胞的培養(yǎng)及注意事項(xiàng)［J］.中國心臟起搏與心電生理雜志，2003，17（3）：230-232.

［5］Simpson P，Savion S.Differentiation of rat myocytes in single cell cultureswithandwithoutproliferatingnonmyocardialcells［J］.Circ Res，1982，50：101-106.