李澤良，季德才，張麗

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院泌尿外科，沈陽(yáng) 110001；2.美國(guó)馬里蘭大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科，美國(guó)馬里蘭州 巴爾地摩 21201）

抗上皮細(xì)胞生長(zhǎng)抑制因子（antiproliferative factor，APF）由Keay等［1］首先發(fā)現(xiàn)于間質(zhì)性膀胱炎（interstitial cystitis，IC）患者的尿液中，并偶然發(fā)現(xiàn)其具有抗膀胱腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。目前，國(guó)內(nèi)尚無(wú)關(guān)于APF對(duì)膀胱移行細(xì)胞癌方面研究的報(bào)道。本研究通過(guò)四唑鹽比色法（MTT）、Western blot探討了不同濃度的有活性APF及無(wú)活性APF對(duì)人膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞株T-24細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人膀胱移行細(xì)胞癌T-24細(xì)胞株購(gòu)自武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；有活性與無(wú)活性的APF購(gòu)自Peptide公司；MTT購(gòu)自Applygen Technologies公司；人肝素結(jié)合性表皮生長(zhǎng)因子（recombinant human heparin binding EGF-like growth factor，HB-EGF）一抗購(gòu)自Santa Cruz公司；兔抗人純化anti-c-Jun一抗購(gòu)自Biolegend公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組：T-24細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)至細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，隨機(jī)將細(xì)胞分為6組，并加入不同濃度 APF：有活性 APF 0，0.5，1.0 μg/ml組，無(wú)活性APF 0，0.5，1.0 μg/ml組。

1.2.2 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖情況：將細(xì)胞懸液100μl（1×106個(gè)細(xì)胞）加入 96孔板中，37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)至細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，含不同濃度APF的培養(yǎng)基200μl加入孔內(nèi)，培養(yǎng)48 h，每孔加入20μl MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)490 nm處各孔的吸光值。每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。各組吸光值用x±s表示。

1.2.3 Western-blot檢測(cè)c-Jun及HB-EGF蛋白的表達(dá)：向各組細(xì)胞中加入細(xì)胞裂解緩沖液，提取細(xì)胞全蛋白，測(cè)定蛋白濃度，取20μg蛋白行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。用含5%脫脂奶粉的PBS封閉1 h，一抗溶液（用0.1%BSA稀釋200～2 000倍）室溫下振蕩孵育2 h，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗溶液（用0.1%的BSA稀釋2 000倍），室溫下振蕩孵育1.5～2 h。堿性磷酸酶法顯色后，行透視掃描（Acer），采用灰度分析軟件（聯(lián)合生物公司，北京）分析灰度值。β-actin用作內(nèi)參照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以x±s表示，各組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT結(jié)果（圖1）

有活性 APF 0μg/ml組、0.5μg/ml組、1.0μg/ml組及無(wú)活性APF組吸光值分別為0.968±0.042、0.729±0.024、0.445±0.035、0.994±0.059，有活性 APF 0μg/ml組、0.5μg/ml組、1.0μg/ml組之間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。

2.2 Western blot結(jié)果

對(duì)Western blot結(jié)果進(jìn)行半定量分析，結(jié)果顯示，有活性 APF 對(duì) c-Jun（圖 2）和 HB-EGF（圖 3）蛋白的表達(dá)有抑制作用，并且隨濃度的增加該抑制作用增強(qiáng)，而無(wú)活性APF對(duì)兩者則無(wú)抑制作用。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，不同濃度有活性APF組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），無(wú)活性的APF各組與有活性APF 0μg/ml組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。

3 討論

抗上皮細(xì)胞生長(zhǎng)抑制因子（APF）是一種由9個(gè)氨基酸與半乳糖相連的熱穩(wěn)定、小分子量多肽，主要存在于間質(zhì)性膀胱炎患者的尿液中，由病變的膀胱移行細(xì)胞產(chǎn)生和分泌，具有強(qiáng)烈的抗膀胱上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的作用［1~7］。

另有研究發(fā)現(xiàn)，APF還具有抗膀胱腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，該作用可能與其抑制AP-1和HB-EGF的表達(dá)有關(guān)。AP-1是一種細(xì)胞活性因子，是由Jun-Jun，Jun-Fos，或Jun-Atf家族蛋白組成的同源或異源二聚體。AP-1屬于基本的亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子［8］，通過(guò)在啟動(dòng)子區(qū)與特異AP-1 DNA連接位點(diǎn)連接［9］，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，從而影響細(xì)胞的增殖、分化、炎癥、宿主反應(yīng)及惡變。APF作用細(xì)胞后，其c-Jun的表達(dá)水平明顯下降，導(dǎo)致AP-1的整體水平下降，活性降低，影響抑癌基因p53及細(xì)胞周期調(diào)控基因p21WAF1/CIP1的表達(dá)，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)［10］。HB-EGF能夠通過(guò)自分泌調(diào)節(jié)人類(lèi)膀胱上皮細(xì)胞生長(zhǎng)，同時(shí)對(duì)于膀胱腫瘤也有較強(qiáng)的促增生作用。在人膀胱癌細(xì)胞中，HB-EGF通過(guò)結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶而觸發(fā)不同的生物反應(yīng)，從而激活ErK/MARK途徑［11］，APF 則可以激活 p38/MAPK 途徑［13］。有關(guān)學(xué)者在對(duì)間質(zhì)性膀胱炎的病因研究中發(fā)現(xiàn)，APF具有強(qiáng)烈的抑制HB-EGF功能及分泌的作用［1］，它能夠抑制HB-EGF引起的ErK/MARK磷酸化的激活［12］，從而影響膀胱腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)及增殖。

本研究采用MTT方法檢測(cè)了不同濃度有活性APF及無(wú)活性APF對(duì)人膀胱癌T-24細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖的影響。結(jié)果顯示，有活性APF對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用，而無(wú)活性APF則對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)明顯抑制作用。Western blot結(jié)果顯示，加入無(wú)活性 APF 0 μg/ml、0.5 μg/ml、1.0 μg/ml細(xì)胞的c-Jun與HB-EGF的蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著差別，而有活性APF 0.5μg/ml組、1.0μg/ml組的c-Jun、HB-EGF蛋白表達(dá)水平，與上述4組比較，有明顯的減低，且有活性APF 1.0μg/ml組比0.5μg/ml組的減低更顯著，說(shuō)明c-Jun與HB-EGF兩者的蛋白表達(dá)隨加入有活性APF劑量的增加而減低。以上結(jié)果提示，加入的有活性APF抑制了人膀胱癌T-24細(xì)胞c-Jun與HB-EGF的蛋白表達(dá)與生長(zhǎng)，而無(wú)活性的APF則無(wú)此作用。

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