張永紅，賀興鄂，唐曉鵬，王文龍，羅開忠

（中南大學(xué) 湘雅二醫(yī)院肝病研究所，長沙 410011）

乙型肝炎病毒（hepatitis Bvirus，HBV）的持續(xù)感染與肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)［1］。雖然HBV感染引起HCC的發(fā)生機制尚未闡明，但研究發(fā)現(xiàn)HBV編碼的X蛋白（hepatitis B virus X protein，HBx protein）可反式激活宿主和病毒基因的啟動，具有廣泛的生物學(xué)活性，85%HCC患者的肝組織中含有特異性的HBx蛋白，提示HB x基因在HCC的發(fā)生中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用［2~4］。釀酒酵母YKL-40蛋白在惡性腫瘤組織中常被激活，在腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用。我們通過小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）使HB x基因沉默，研究了HBx蛋白對YKL-40蛋白表達的影響，不僅對探討HBV相關(guān)性HCC的發(fā)生機制具有重要意義，還為通過阻斷HBx蛋白表達影響腫瘤相關(guān)基因的表達來防治HCC提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株和腫瘤細胞：質(zhì)粒pRNAT-U6.1/Neo（GenScript）、大腸桿菌DH5α、人肝癌細胞系HepG 2.2.15細胞均為本實驗室保存。

1.1.2 試劑：T4 DNA連接酶、BamHI內(nèi)切酶、HindⅢ內(nèi)切酶、G418、小量質(zhì)粒DNA純化試劑盒等均購自Progmega公司；DNA marker和RT試劑盒購自Ferments公司；轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體Lipofectamin 2000和Trizol regent購自Invitrogen公司；DMEM（高糖）和胎牛血清購自Gibco公司；鼠抗HBx一抗和鼠抗YKL-40一抗購自ABcam公司，鼠抗YKL-40一抗購自R&D公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記兔抗鼠二抗、HRP標(biāo)記兔抗鼠二抗購自Santa Cruz公司；DAB染色試劑盒購自KPL公司。

1.2 方法

1.2.1 siRNA表達模板的設(shè)計與合成：針對HBV基因組中X基因選取一段靶序列：5′TGCTAGGGTGTGCTGCCAACT 3′，再根據(jù)這段序列按照質(zhì)粒的要求設(shè)計一對siRNA模板，具有特殊的序列與結(jié)構(gòu)，所表達的RNA為短發(fā)夾結(jié)構(gòu)，見圖1。另外，作為陰性對照，設(shè)計一條隨機無關(guān)序列：5′CCTGCGTTGATGCCTTTGCCT 3′，根據(jù)這段序列再設(shè)計一對siRNA模板序列，由上海生工生物工程公司合成。

1.2.2 siRNA表達質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定：將上述合成的模板DNA鏈分別用水配成1μg/μl的溶液，各取5 μl，加入 2μl退火緩沖液（2 mol/L NaCl）和 8μl水，混勻后于95℃水浴5 min變性，自然冷卻退火成雙鏈DNA，與BamHⅠ和HindⅢ雙酶切的質(zhì)粒pRNAT-U6.1/neo連接，在T4連接酶作用下，16℃連接過夜；轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細菌，于Amp陽性的LB平板上37℃培養(yǎng)過夜；挑取生長良好的單個菌落接種于Amp陽性的LB液體培養(yǎng)基中擴增，提取質(zhì)粒測序鑒定。

1.2.3 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：HepG2.2.15細胞使用含10%胎牛血清和G418（400μg/ml）的DMEM高糖培養(yǎng)基，置37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細胞貼壁生長至80%～90%融合狀態(tài)時用0.25%胰酶消化進行傳代培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1 d用0.25%胰酶消化培養(yǎng)瓶中的細胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為5×105/ml，于60 mm×25 mm細胞培養(yǎng)皿加入3 ml細胞懸液，培養(yǎng)24 h左右，使細胞全部貼壁；按照Lipofectamin 2000說明書，于2個細胞培養(yǎng)皿中分別轉(zhuǎn)染4μg質(zhì)粒pRNAT-Neg和pRNAT-HBx。24 h后細胞使用有限稀釋法，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，熒光顯微鏡下觀察綠色螢光蛋白（green fluorescent protein，GFP）表達，篩選出陽性單細胞克隆，建立穩(wěn)定細胞株，分別命名為2215-Neg和2215-HBx。將細胞設(shè)為空白對照組（2.2.15）、陰性對照組（2215-Neg）和實驗組（2215-HBx），按 1×106/孔接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，每組3個平行孔，培養(yǎng)72 h收獲細胞。

1.2.4 RT-PCR檢測HB x與YKL-40 mRNA的表達水平：采用Trizol法分別提取細胞總RNA，各取5μg RNA按照RT-PCR試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，然后PCR擴增目的片段。HB x基因的PCR上游引物為 5′ATGGCTGCTAGGGTGTGCTG 3′，下游引物為 5′CGACGTACAGAGGTGAGGCG 3′，擴增產(chǎn)物片段大小為233 bp；YKL-40的上游引物為5′GGATGGAACTTTGGGTCTCA 3′，下游引物為 5′GCTGTTTGTCTCTCCGTCCA 3′，擴增產(chǎn)物片段長度為154 bp；同時以3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）作為陽性內(nèi)對照，GAPDH的上游引物為5′CCACCCATGGCAAATTCCATG 3′，下游引物為 5′TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC 3′，擴增片段長度為574 bp。PCR條件為94℃預(yù)變性3 min，94℃30 s，58℃ 30 s，72℃ 45 s，共 35個循環(huán)，72℃延伸 7 min，PCR產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.5 Western blot檢測HBx與YKL-40蛋白的表達情況：每孔細胞收集后加入200μl細胞裂解液，200 W超聲破碎10 s，4℃、16 000 r/min離心2 min，取上清進行蛋白定量，按20μg/孔行12%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗（1∶500稀釋），4℃過夜；PBS洗滌 3次，5 min/次，加入酶標(biāo)二抗（1∶500稀釋），室溫 2 h；PBS洗滌 3次，5 min/次，DAB染色。

1.2.6 細胞免疫熒光：細胞按上述3組于6孔板中進行細胞爬片，待細胞生長至50%~60%融合，取出玻片，PBS沖洗，4%多聚甲醛固定10 min；PBS洗2遍，加入透化液靜置10 min；PBS洗4遍，加入5%BSA封閉30 min；加入一抗（1∶50稀釋），室溫1 h；PBS洗4遍，加入熒光二抗（1∶50稀釋），避光1 h；PBS洗4次，熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 siRNA表達質(zhì)粒的構(gòu)建

重組質(zhì)粒測序結(jié)果確定siRNA模板已正確插入質(zhì)粒，圖2所示為重組質(zhì)粒pRNAT-neg和pRNAT-HBx的測序圖譜中截取的siRNA模板（測的是反義鏈）。

2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定細胞株的建立

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后24 h即可觀察到GFP的表達，有限稀釋法于96孔板中篩選到陽性單細胞克隆，擴大培養(yǎng)即獲得穩(wěn)定細胞株2215-neg和2215-HBx，熒光顯微鏡下照相，可見空白2.2.15細胞無熒光蛋白表達，而穩(wěn)定細胞株2215-neg和2215-HBx均有GFP表達，見圖3。

2.3 RT-PCR檢測HB x和YKL-40 mRNA的表達

PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖4）顯示，GAPDH作為陽性內(nèi)對照，可見清晰條帶；實驗組細胞HB x和YKL-40的mRNA水平明顯低于空白對照組及陰性對照組，而空白對照組及陰性對照組HB x和YKL-40的mRNA水平無明顯差別，表明pRNAT-HBx可明顯抑制HepG2.2.15細胞中HB x的mRNA表達，YKL-40的mRNA水平隨HB x基因的下調(diào)而降低。

2.4 Western blot檢測HBx和YKL-40蛋白的表達水平

Western blot結(jié)果（圖 5）顯示，β-actin內(nèi)參照的表達均在同一水平，實驗組細胞HBx和YKL-40蛋白的表達明顯低于空白對照組及陰性對照組，而空白對照組及陰性對照組HBx和YKL-40蛋白的表達水平無明顯差別，表明pRNAT-HBx抑制了HepG2.2.15細胞中HBx蛋白的表達，YKL-40的蛋白水平隨HBx蛋白的下調(diào)而降低。

2.5 細胞免疫熒光檢測細胞內(nèi)HBx和YKL-40蛋白的表達情況

熒光顯微鏡下，空白對照組及陰性對照組細胞質(zhì)內(nèi)均有很強的綠色熒光，而實驗組細胞質(zhì)內(nèi)綠色熒光明顯減弱。提示HBx和YKL-40在各組細胞內(nèi)的蛋白表達情況與RT-PCR和Western blot結(jié)果一致，見圖6。

3 討論

HB x基因是HBV基因組中最小的閱讀框架，在感染哺乳動物的HBV中高度保守，HBV感染后，病毒基因組常整合入宿主細胞基因組造成宿主細胞染色體不穩(wěn)定。X基因是最常被整合的基因，大多數(shù)肝癌細胞株及HCC都含有部分或全部的HB x基因，整合形式的X基因產(chǎn)生HBx蛋白，分子量約17 kDa［5］。作為一種反式激活因子，HBx蛋白能激活宿主細胞和病毒自身基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控細胞凋亡，抑制細胞中受損DNA的修復(fù)反應(yīng)及激活細胞中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。HBx蛋白本身不能與雙鏈DNA直接結(jié)合，主要通過與宿主細胞中的蛋白發(fā)生相互作用，產(chǎn)生兩方面的效應(yīng)：一是通過與一些轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白的相互作用，在轉(zhuǎn)錄水平上激活或抑制某些基因的轉(zhuǎn)錄；二是通過直接與控制細胞活力和增殖能力的調(diào)控蛋白及一些未知的細胞蛋白之間的相互作用，影響宿主細胞中這些蛋白的功能［6］。

YKL-40又名人類軟骨糖蛋白-39，生理狀態(tài)下可由巨噬細胞、中性粒細胞、軟骨細胞、血管平滑肌細胞等分泌，在炎癥相關(guān)性疾病及乳腺癌、卵巢癌、小細胞肺癌、黑色素瘤等多種腫瘤組織中呈高表達，它在腫瘤細胞增殖、生存、侵襲力、腫瘤周圍的炎性反應(yīng)、血管形成、腫瘤細胞外基質(zhì)的重建以及腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用［7］。目前其對腫瘤細胞的具體作用機制還不十分清楚，有研究發(fā)現(xiàn)肝癌原發(fā)瘤細胞株H2-P中凋亡抑制基因Clusterin的導(dǎo)入可以明顯上調(diào)YKL-40蛋白的表達，促進腫瘤細胞的體外遷移和體內(nèi)成瘤及轉(zhuǎn)移；而且在肝癌原發(fā)瘤和轉(zhuǎn)移瘤組織中，YKL-40蛋白表達與Clusterin蛋白水平均密切相關(guān)。推測YKL-40可能是Clusterin基因作用的下游靶基因［8］。

HepG2.2.15細胞是轉(zhuǎn)染了克隆的HBV-DNA的肝癌細胞系［9］，主要應(yīng)用于體外遺傳毒理學(xué)實驗、外源性生物異物的細胞毒性、HBV感染機制等方面的研究。由于整合了HBV全長基因組，HepG2.2.15細胞能夠穩(wěn)定表達HBx蛋白。

siRNA是一種小RNA分子，由Dicer（RNAaseⅢ家族中對雙鏈RNA具有特異性的酶）加工而成。RNA 干擾（RNA interference，RNAi）是一種強大的實驗工具，利用具有同源性的雙鏈RNA誘導(dǎo)序列特異的目標(biāo)基因的沉默，迅速阻斷基因活性。siRNA在RNA沉默通道中起中心作用，是對特定mRNA進行降解的指導(dǎo)要素。siRNA是RNAi途徑中的中間產(chǎn)物，是RNAi發(fā)揮效應(yīng)所必需的因子。siRNA只降解與其序列互補配對的mRNA，其調(diào)控機制是通過互補配對而沉默相應(yīng)靶位基因的表達，所以是一種典型的負調(diào)控機制。

我們通過研究發(fā)現(xiàn)siRNA可明顯抑制HepG2.2.15細胞中HBx蛋白的表達，觀察到Y(jié)KL-40的mRNA、蛋白、細胞內(nèi)蛋白的表達水平也隨之相應(yīng)下調(diào)，提示HBx蛋白可能在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平雙方面影響YKL-40的蛋白表達。由此推斷HBx蛋白在HepG2.2.15細胞中對YKL-40蛋白具有一定的激活作用，從而抑制HBx蛋白的表達，其對YKL-40蛋白的激活作用減弱，致使YKL-40蛋白水平降低到接近原來的水平。根據(jù)HBx的生物功能和類似研究［10］，猜測其可能通過NF-κB信號通路或者與蛋白翻譯相關(guān)因子相互作用來影響YKL-40蛋白的表達，這還有待進一步研究證實。

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