薛 莎朱瓊潔馬 威

伸秦組方對高尿酸血癥小鼠的影響

薛 莎1朱瓊潔2馬 威1

目的： 探討伸筋草、車前子、秦皮、絡(luò)石藤等中藥組方（簡稱伸秦組方）對高尿酸血癥小鼠的影響及作用機(jī)制。方法：采取聯(lián)合使用腺嘌呤、乙胺丁醇、酵母膏連續(xù)灌胃給藥，制備小鼠高尿酸血癥模型。同時給予西藥和中藥伸秦組方進(jìn)行對照，26天后檢測各組小鼠的血清尿酸值和黃嘌呤氧化酶（XOD）、腺苷脫氨酶（ADA）的活性；并取腎臟做組織切片，在光鏡下觀察其組織變化。結(jié)果：伸秦組方能降低小鼠血尿酸（與模型組比，P＜0.01），在抑制ADA和XOD活性方面優(yōu)于其余各組（P＜0.01）。中藥組小鼠腎臟中尿酸結(jié)晶較西藥組少，腎臟損害較小。結(jié)論：伸秦組方有治療高尿酸血癥和良好的腎臟保護(hù)作用。

伸秦組方 高尿酸血癥 血尿酸 黃嘌呤氧化酶 腺苷脫氨酶 影響

痛風(fēng)是一種嘌呤代謝紊亂所致的疾病，其特點(diǎn)為高尿酸血癥。近年隨著我國人民生活水平的提高，高尿酸血癥的發(fā)病率逐年遞增，且發(fā)病年齡呈現(xiàn)低齡化趨勢[1，2]。高尿酸血癥可續(xù)發(fā)痛風(fēng)、尿酸性腎病、腎功能不全，且與高血壓病、高血脂、冠心病、腦卒中、糖尿病的發(fā)生密切相關(guān)，其防治工作也日益受到重視[3，4]。目前，痛風(fēng)的西醫(yī)治療多依賴秋水仙堿、別嘌呤醇、苯溴馬隆等藥物，緩解癥狀，控制病情發(fā)展，但副作用大。最近幾年由于痛風(fēng)發(fā)病率的上升，人們越來越重視痛風(fēng)的治療研究，而中藥治療痛風(fēng)有了較快的發(fā)展。由伸筋草、秦皮、車前子、絡(luò)石藤等中藥顆粒組成的中藥組方（以下簡稱伸秦組方），具有清熱燥濕、利尿、祛風(fēng)通絡(luò)等作用，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其主要成分能促進(jìn)尿酸排泄、消炎鎮(zhèn)痛，因此我們進(jìn)行此實(shí)驗(yàn)以了解伸秦組方治療高尿酸血癥的作用機(jī)理。

一、材料與方法

（一）實(shí)驗(yàn)動物

SPF級昆明小鼠110只，雄性，(20±2)g/只，由湖北省疾病防控中心提供（實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)許可證號：SCXK[鄂]2003-2005）。小鼠飼養(yǎng)于武漢市第一醫(yī)院SPF動物實(shí)驗(yàn)室。造模前適應(yīng)環(huán)境1周，整個實(shí)驗(yàn)過程中自由攝食和飲水。

（二）藥品與試劑

1．藥品

（1）造模藥品：腺嘌呤（購自上海悠祥生化試劑有限公司，批號20080123）；乙胺丁醇（購自武漢中聯(lián)集團(tuán)四藥藥業(yè)有限公司，批號070801）；酵母膏（購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號20070906）。

（2）治療藥品：伸秦組方由江陰制藥廠生產(chǎn)的顆粒劑型伸筋草、車前子、秦皮、絡(luò)石藤等組成（伸筋草批號 0807114，車前子批號0807021，秦皮批號0808046，絡(luò)石藤批號0804104）；別嘌呤醇（購自廣東彼迪藥業(yè)有限公司，批號20080305）；苯溴馬隆（購自宜昌長江藥業(yè)有限公司，批號071101）。

2．試劑

尿酸試劑（氧化酶法）（購自上海科華東菱診斷用品有限公司，批號20080312）。黃嘌呤氧化酶（XOD）測試盒（購自南京建成生物工程研究所，批號20080729）；腺苷脫氨酶（ADA）測試盒（購自南京建成生物工程研究所，批號20080729）。

（三）儀器

實(shí)驗(yàn)中使用儀器為TU—1800S紫外可見分光光度計；Certrifuge B4i離心機(jī)；PL402-L電子分析天枰；Axioskop40光鏡。

（四）方法

1．分組及給藥方法

將小鼠隨機(jī)分為5組：空白組15只，模型組29只，伸秦組方治療組22只，別嘌呤醇組22只，苯溴馬隆組22只。除空白組灌胃生理鹽水26天（50 ml·kg-1，1次/d）外，其余各組均灌胃腺嘌呤100mg·kg-1、乙胺丁醇250 mg·kg-1，酵母膏15g·kg-1組成的混合物1ml，每日1次，連續(xù)26天給予，并給藥治療（1ml/d灌胃）。伸秦組方按50g·kg-1/d灌胃給藥；別嘌呤醇組按40mg·kg-1/d灌胃給藥；苯溴馬隆組按20mg·kg-1/d灌胃給藥。

2．血尿酸的檢測

第26天，將小鼠禁食5h后，眼球取血，室溫下自然凝固1h，再于每分鐘3500轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)速下離心10分鐘，取上清液，檢測血尿酸。

3．黃嘌呤氧化酶（XOD）和腺苷脫氨酶（ADA）活性的測定

4℃下快速取出小鼠腎臟，稱重后加入5倍體積的80mmol/L的磷酸鹽緩沖液，在冰浴中充分勻漿。4℃、每分鐘3000轉(zhuǎn)速下離心10分鐘，取上清液在4℃、每分鐘10000轉(zhuǎn)速下離心60分鐘，取上清液采用分光光度法測定XOD 和ADA的活性[5]。

4．組織學(xué)送檢

取各組小鼠腎臟，用4%多聚甲醛浸泡固定，石蠟包埋切片，經(jīng)HE染色，封片后光鏡下觀察。根據(jù)其纖維增生的程度分為Ⅲ級。Ⅰ級：腎小管上皮細(xì)胞有灶性水腫，間質(zhì)有炎細(xì)胞浸潤，病變范圍＜15%；Ⅱ級：腎小管上皮細(xì)胞有小片性水腫，間質(zhì)有炎細(xì)胞浸潤，有膿尿、蛋白尿、尿酸結(jié)晶形成，病變范圍＞15%且≤50%；Ⅲ級：腎小管上皮細(xì)胞有片狀水腫，間質(zhì)有炎細(xì)胞浸潤、輕度纖維化，有膿尿、蛋白尿、尿酸結(jié)晶形成，病變范圍＞50%。

（五）統(tǒng)計分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理，多組間用方差分析比較，兩組間采用t檢驗(yàn)。

二、結(jié)果

（一）治療后各組小鼠血尿酸的比較

模型組與空白組有顯著差異(P＜0.01)，證明造模成功。伸秦組方、別嘌呤醇組和苯溴馬隆組與模型組有顯著差異(P＜0.01)，證明治療藥物有效。伸秦組方的血尿酸值與西藥治療組比較，無明顯差異（P＞0.05）（見表1）。

（二）治療后各組XOD和ADA活性比較

模型組ADA的活性高于空白組，證明造模成功。伸秦組方ADA的活性與空白組比較無顯著差異（P＞0.05），與西藥組比較有顯著差異（P＜0.01），證明伸秦組方抑制ADA的活性效果優(yōu)于其他治療組。從XOD活性來看，伸秦組方的XOD活性低于模型組和其他治療組，與模型組比較有顯著差異（P＜0.01），與西藥組比較有明顯差異（P＜0.05），證明其抑制XOD活性的作用優(yōu)于其余治療組，從而抑制尿酸生成（見表1）。

表1 各組小鼠的血尿酸，血清XOD和ADA活性的比較（ˉx±s）

（三）腎小球，腎小管-間質(zhì)的病理改變

模型組可見腎小管上皮細(xì)胞有片狀水腫，間質(zhì)有炎細(xì)胞浸潤、輕度纖維化，病變范圍＞50%；伸秦組方及西藥組病變程度較模型組輕，腎小管上皮細(xì)胞有灶性水腫，間質(zhì)有炎細(xì)胞浸潤，病變范圍＜15%（見圖1）。

圖1 各組小鼠腎臟組織切片的病理改變圖

三、討論

腺嘌呤是一種含氮雜環(huán)嘌呤類化合物，其最終代謝產(chǎn)物是尿酸。當(dāng)給大鼠灌胃腺嘌呤后，體內(nèi)合成尿酸的底物——磷酸核糖焦磷酸和/或谷酰胺增加；另外，谷酰胺磷酸核糖焦磷酸轉(zhuǎn)移酶及黃嘌呤氧化酶的活性也可能增加，使尿酸合成加速。尿酸在血中呈過飽和狀態(tài)而形成結(jié)晶，沉積于腎間質(zhì)及髓質(zhì)，刺激局部，引起腎小管-間質(zhì)化學(xué)炎性反應(yīng)，間質(zhì)可見炎性細(xì)胞浸潤及纖維化。乙胺丁醇抑制尿酸排泄，增加尿酸在體內(nèi)的蓄積，從而提高血尿酸濃度[6]。酵母含有豐富的蛋白質(zhì)、核苷酸、B族維生素等，在體內(nèi)充分水解能產(chǎn)生含氮的有機(jī)堿(包括嘌呤堿類、嘧啶堿類)和磷酸，當(dāng)大劑量的酵母進(jìn)入體內(nèi)后，能干擾機(jī)體正常的嘌呤代謝，致嘌呤代謝紊亂，其主要表現(xiàn)為黃嘌呤氧化酶活性增加，加速了尿酸的生成，從而產(chǎn)生大量尿酸[7]。

本次實(shí)驗(yàn)的預(yù)實(shí)驗(yàn)是參照文獻(xiàn)[7-9]進(jìn)行的，采用加速尿酸合成、抑制尿酸排泄和進(jìn)食大量高嘌呤食物三種相結(jié)合的方法，給予小鼠腺嘌呤、乙胺丁醇和酵母膏灌胃，結(jié)果第21天時血尿酸高于空白組（P＜0.05），有顯著性差異，證明用此方法造模成功。之后用此方法繼續(xù)灌胃，到第26天時血尿酸仍高于空白組（P＜0.05），有顯著性差異，證明此造模方法可以使小鼠血尿酸持續(xù)升高26天。由于此方法對小鼠腎臟的損壞較小，故決定用此造模方法進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。

別嘌呤醇可以抑制黃嘌呤氧化酶，減少尿酸的生成。苯溴馬隆抑制腎小管回吸收尿酸的作用強(qiáng)，從而促進(jìn)尿酸的排泄[5]。

從本次實(shí)驗(yàn)來看，使用的造模方法是成功的，伸秦組方對血尿酸、XOD和ADA活性的影響也很顯著，其抑制XOD和ADA的活性效果優(yōu)于其他治療組，從而抑制尿酸生成，具有良好的抗高尿酸血癥作用。從經(jīng)HE染色的組織切片來看，伸秦組方能減輕高尿酸血癥對腎臟超微結(jié)構(gòu)的損傷，抑制腎間質(zhì)纖維化，減輕疾病病變的進(jìn)展程度，延緩疾病的自然過程，具有良好的腎臟保護(hù)作用。

痛風(fēng)一病，中醫(yī)經(jīng)典中曾作了詳細(xì)的記載，《丹溪心法·痛風(fēng)》、《類證治載·痛風(fēng)》、《證治準(zhǔn)繩·痛風(fēng)》、《張氏醫(yī)通·痛風(fēng)》、《素問·異法方宜論》中均有論證。中醫(yī)認(rèn)為本病病因是痰濕瘀血濁毒，病機(jī)是脾腎虧虛，痰瘀互結(jié)，閉阻經(jīng)絡(luò)，飲食、情志、寒濕是痛風(fēng)的相關(guān)致病因素[10]。

伸秦組方是由伸筋草、秦皮、車前子、絡(luò)石藤等中藥組成，具有清熱燥濕、利尿、祛風(fēng)通絡(luò)等作用。伸筋草祛風(fēng)除濕，舒經(jīng)活絡(luò)，含伸筋草堿、伸筋草毒、石松堿，提取物能鎮(zhèn)痛；石松能利尿及增進(jìn)尿酸排泄。秦皮，清熱燥濕，早年曾報道秦皮苷有利尿作用，并能促進(jìn)家兔以及風(fēng)濕病患者尿酸排泄。秦皮甲素多種給藥途徑也可促進(jìn)大鼠及兔的尿酸排泄，其促進(jìn)尿酸排泄的機(jī)理與興奮交感神經(jīng)系統(tǒng)抑制腎臟對尿酸的重吸收等有關(guān)[11]。車前子，利尿通淋滲濕，藥理研究表明其能抑制腎臟草酸鈣結(jié)晶，煎劑少量多次注入兔膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)，能引起結(jié)締組織增生，加強(qiáng)關(guān)節(jié)囊的緊張度[12]。絡(luò)石藤祛風(fēng)通絡(luò)，涼血消腫，《本草綱目》云：“絡(luò)石，氣味平和，其力主筋骨關(guān)節(jié)風(fēng)熱癰腫”，藥理研究發(fā)現(xiàn)其具有類似腎上腺皮質(zhì)激素樣作用[13]。雖然別嘌呤醇和苯溴馬隆均能降低血尿酸，但這些藥物長期應(yīng)用有損害肝、腎功能，抑制骨髓等毒副作用，停藥后血尿酸極易反跳，又不能消除尿蛋白，也不能改變膠原代謝抗腎纖維化，對防止高尿酸血癥的發(fā)生、發(fā)展均有極大的局限性[14]。中醫(yī)藥由于作用溫和，能夠長期服藥，在治療高尿酸血癥方面具有一定的優(yōu)勢。伸筋草、車前子、秦皮、絡(luò)石藤等組成的伸秦組方在長期應(yīng)用過程中證明了其能夠降低血尿酸，具有良好的治療高尿酸血癥作用；本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)其能有效降低血尿酸，是通過抑制XOD和ADA兩種酶的活性，影響尿酸代謝完成的。所以，由伸筋草、車前子、秦皮、絡(luò)石藤等組成的伸秦組方應(yīng)該得到進(jìn)一步的推廣，以更好地解除病人的痛苦。

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1薛莎，馬威，武漢市第一醫(yī)院，武漢，430022

2朱瓊潔，湖北中醫(yī)學(xué)院2006級研究生，武漢，430061