李光明 段百蕓

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,且發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。乳腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生較早,同時(shí)又是決定乳腺癌分期和選擇治療方案最關(guān)鍵的因素之一。新近發(fā)現(xiàn)的 LYVE-1被認(rèn)為是目前特異性最強(qiáng)的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物之一,尤為引人注目。本研究采用免疫組化方法檢測(cè) LYVE-1在乳腺腫瘤中的表達(dá),計(jì)數(shù)淋巴管密度(lymphatic vessel density,LVD),并對(duì) LVD與臨床病理參數(shù)作相關(guān)性分析,進(jìn)一步探討淋巴管生成與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系,為治療乳腺腫瘤及判斷預(yù)后提供新思路。

1 資料與方法

1.1 資料

收集 2006年 1月 ～2007年 10月手術(shù)切除并經(jīng)病理檢查證實(shí)為原發(fā)性乳腺癌的石蠟包埋標(biāo)本 100例,所有患者均為女性,術(shù)前未作過(guò)放、化療及內(nèi)分泌治療?；颊吣挲g 30～79歲,中位年齡 51歲。參照 2003年 WHO乳腺癌病理診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織學(xué)分型,100例乳腺癌中浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌 70例,導(dǎo)管內(nèi)癌 11例,混合型8例,小葉癌 6例,髓樣癌 3例,Paget病 2例;伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 48例,無(wú)轉(zhuǎn)移者 52例。參照 1997年 UICC腫瘤TMN標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床分期Ⅰ期 23例,Ⅱ期 49例,Ⅲ期28例。

1.2 方法

石蠟標(biāo)本 4μm厚連續(xù)切片,采用 Envision二步法免疫組化染色,實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。所用一抗 LYVE-1為鼠抗人單克隆抗體,購(gòu)自 R＆D公司,工作濃度為 1∶40,PV9000試劑盒,購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。以 PBS液代替一抗為陰性對(duì)照,已知陽(yáng)性的結(jié)腸癌組織切片為陽(yáng)性對(duì)照(隨試劑附帶)。

1.3 結(jié)果判讀

1.3.1 LYVE-1陽(yáng)性的判讀 淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)呈現(xiàn)棕褐色或黃褐色為 LYVE-1染色陽(yáng)性表達(dá)。

1.3.2 LVD計(jì)數(shù) 參照 Schoppmann[1]的方法進(jìn)行計(jì)數(shù),先于低倍鏡(×40倍)下掃描腫瘤周邊部 LYVE-1陽(yáng)性淋巴管密集區(qū),即“熱區(qū)”。然后在高倍鏡(×200倍)視野下計(jì)數(shù) 5個(gè)熱區(qū)中 LYVE-1陽(yáng)性淋巴管數(shù),取平均值,即為淋巴管密度。著棕黃色、不含紅細(xì)胞、無(wú)肌性或纖維性管壁、可有內(nèi)皮細(xì)胞的不整形管腔視為L(zhǎng)YVE-1陽(yáng)性微淋巴管。管腔明顯管壁完整不論有無(wú)內(nèi)皮細(xì)胞、管壁不完整但有內(nèi)皮細(xì)胞,或成叢的內(nèi)皮細(xì)胞形成多個(gè)迂回相連的管腔均計(jì)數(shù)為 1個(gè)微淋巴管。用盲法判定結(jié)果,每張切片由兩名高年資病理科醫(yī)師計(jì)數(shù),計(jì)數(shù)差 10%以上則重新計(jì)數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

結(jié)果用 SSPS11.5統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理,LYVE-1所標(biāo)記淋巴管的密度各組數(shù)據(jù)均用均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示,各組及組間LVD比較及其與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性,采用 t檢驗(yàn)、Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)或方差分析。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌和乳腺纖維腺瘤組織中的 LVD

LYVE-1陽(yáng)性產(chǎn)物為棕黃色顆粒,絕大多數(shù)表達(dá)在淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞上,且多位于腫瘤間質(zhì)。乳腺癌癌旁組織淋巴管管壁呈棕褐色,數(shù)量多,管腔開(kāi)放,形態(tài)不規(guī)則,管壁較薄。LYVE-1所標(biāo)記的乳腺癌癌旁組織淋巴管的平均密度為(9.52±3.47),乳腺纖維瘤組織中淋巴管的平均密度為(1.31±1.02),兩者比較,P＜0.01,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說(shuō)明乳腺惡性腫瘤中淋巴管的密度高于乳腺纖維腺瘤。

2.2 LVD與乳腺癌各臨床病理參數(shù)的關(guān)系

LVD與乳腺癌患者的年齡、腫瘤大小、組織學(xué)類(lèi)型、雌激素受體(estrogen receptor,ER)、孕激素受體(progesterone receptor,PR)和 c-erbB2無(wú)顯著相關(guān)(P＞0.05),但與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床病理分期顯著相關(guān)(P＜0.01)。特別是,乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者 LVD顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P＜0.01),提示乳腺癌 LVD與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),見(jiàn)表 1。

表1 乳腺癌LVD與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

3 討論

侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的基本特征,也是腫瘤患者致死的主要原因之一。大量臨床及病理觀察表明,淋巴道轉(zhuǎn)移是腫瘤轉(zhuǎn)移的最常見(jiàn)及最基本的途徑;在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的過(guò)程中,腫瘤的血管和淋巴管生成是腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的必要條件。但長(zhǎng)期以來(lái)由于缺乏淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)記物,腫瘤淋巴管生成的研究相對(duì)滯后于腫瘤血管生成。近年來(lái),LYVE-1淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn),研究人員利用淋巴管的特異性標(biāo)志物來(lái)計(jì)算單位面積中淋巴管的數(shù)目,即腫瘤組織中的淋巴管密度(LVD),通過(guò)了解腫瘤內(nèi)部和周?chē)欠裼?LVD升高,及 LVD升高是否與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān),作為判斷腫瘤轉(zhuǎn)移與預(yù)后的 1個(gè)指標(biāo)[1]。

LYVE-1,是 Banerji于 1999年發(fā)現(xiàn)的 CD44糖蛋白的同系化合物,其均勻分布于淋巴管內(nèi)外腔面,具有從組織攝取透明質(zhì)酸鹽并轉(zhuǎn)運(yùn)至淋巴液的作用,是被發(fā)現(xiàn)的第 1個(gè)淋巴道透明質(zhì)酸鹽受體,幾乎只特異性地表達(dá)在淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞上,而在血管內(nèi)皮細(xì)胞上沒(méi)有表達(dá)[2]。后來(lái)研究表明 LYVE-1還表達(dá)于炎癥組織中巨噬細(xì)胞的 1個(gè)亞群和肝臟、脾臟血管竇內(nèi)皮細(xì)胞,很快有學(xué)者通過(guò)研究提出這種現(xiàn)象可能與腫瘤細(xì)胞和白細(xì)胞歸巢有關(guān)[3]。LYVE-1的出現(xiàn),使簡(jiǎn)單而準(zhǔn)確地識(shí)別淋巴管成為可能,從而在技術(shù)上使我們得以研究淋巴管生成?，F(xiàn)已有大量的研究以 LYVE-1為標(biāo)記物證實(shí)腫瘤有淋巴管生成,且與腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移具有一定的相關(guān)性[4～6]。

本研究對(duì) 100例乳腺癌標(biāo)本癌旁 LVD檢測(cè)表明,LVD與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床病理分期顯著相關(guān):臨床病理分期越晚,發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,乳腺癌癌旁L(fǎng)VD越高。但與患者的年齡、腫瘤大小、ER、PR和 cerbB2無(wú)顯著相關(guān)。特別是,乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者LVD顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者,提示乳腺癌癌旁 LVD與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。這與 Coskun等[7]的研究結(jié)果一致。表明:LVD是反映乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的 1個(gè)相關(guān)指標(biāo),對(duì)患者預(yù)后判斷有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌癌旁組織淋巴管數(shù)量多,管腔開(kāi)放,形態(tài)不規(guī)則,管壁較薄;乳腺纖維腺瘤組織雖見(jiàn)毛細(xì)淋巴管,但管腔較小,數(shù)量較少;乳腺癌癌旁組織LVD顯著高于乳腺纖維腺瘤組織,與文獻(xiàn)報(bào)道一致。另外,腫瘤和瘤周淋巴管的形態(tài)、結(jié)構(gòu)與正常組織中的淋巴管相比,還存在如下特點(diǎn):在大塊癌巢附件處淋巴管因受擠壓而呈閉塞狀態(tài),其它部位的淋巴管大部分則呈擴(kuò)張或極度擴(kuò)張狀態(tài),管腔擴(kuò)大,突向管腔內(nèi)外的內(nèi)皮質(zhì)膜突起大多消失;內(nèi)皮細(xì)胞的連接方式逐漸由復(fù)雜型向簡(jiǎn)單型轉(zhuǎn)變,大量的連接開(kāi)放便形成較為寬大的內(nèi)皮細(xì)胞通道,癌細(xì)胞可經(jīng)這些通道進(jìn)入淋巴管;隨著腫瘤的生長(zhǎng)這種功能性淋巴管增多,同時(shí)淋巴管管壁結(jié)構(gòu)也發(fā)生變化,在有腫瘤細(xì)胞靠攏的地方會(huì)出現(xiàn)明顯的間隙和缺口,這有利于腫瘤細(xì)胞進(jìn)入淋巴管腔。腫瘤周?chē)嬖诘臄U(kuò)張淋巴管,與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[8]。腫瘤周?chē)牧馨凸?可增加腫瘤邊緣淋巴管的表面積,后者使腫瘤細(xì)胞入侵機(jī)會(huì)增加。淋巴管數(shù)目的增加以及淋巴管的擴(kuò)張,從而導(dǎo)致LVD的增加,這可能是腫瘤細(xì)胞淋巴轉(zhuǎn)移的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)及淋巴管密度的增加的機(jī)理。增生或擴(kuò)張的淋巴管為腫瘤細(xì)胞向淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移提供了途徑,因此研究 LVD及其臨床意義,對(duì)明確淋巴管生成的機(jī)制具有一定的意義,可以為乳腺癌的預(yù)后判斷及抗淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移治療提供理論和試驗(yàn)依據(jù)。

[1] Nathanson SD,Zarbo RJ,Wachna DL,etal.Microvessels that p redict axillay lym ph nodemetastases in patients with breast cancer〔J〕.Arch Surg,2000,135(5):586.

[2] BanerjiS,Ni J,Wang SX,etal.LYVE-1,a new homologue of the CD44 glycoprotein,is a lymph-specific recep tor for hyaluronan〔J〕.JCell Biol,1999,144(4):789.

[3] Jackson DG,Prevo R,Clasper S,et al.LYVE-1,the lymphatic system and tumor lymphangiogenesis〔J〕.Trends Immunol,2001,22(6):317.

[4] Florez-Vargas A,Vargas SO,Debelenko LV,et al.Comparative analysis of D 2-40 and LYVE-1 immunostaining in lymphatic malformations〔J〕.Lymphology,2008,41(3):103.

[5] Chen W,Shen W,Chen M,et al.Study on the relationship between lym phatic vessel density and distal intramural spread of rectal cancer〔J〕.Eur Surg Res,2007,39(6):332.

[6] Kato T,Prevo R,Steers G,et al.A quantitative analysis of lymphatic vessels in human breast cancer,based on LYVE-1 immunoreacity〔J〕.Br JCancer,2005,93(10):1168.

[7] Coskun U,Akyürek N,Dursun A,etal.Peritumoral lymphatic microvessel density associated with tumor progression and poor prognosis in gastric carcinoma〔J〕.JSurg Res,2009,21(3):690.

[8] Padera TP,Kadambi A,di Tomaso E,etal.Lymphatic metastasis in the absence of functional intratumor lymphatic〔J〕.Science,2002,296(5574):1883.