張小芳 趙健雄

原花青素(procyanidins,Pc),是廣泛存在于水果、蔬菜、種籽、花朵和樹皮中的一類多酚化合物的總稱[1],其中葡萄籽原花青素提取物(grape seed procyanidin extract,GSPE)為最早提取成功的原花青素,對其研究也最為廣泛。由于 GSPE安全性(GSPE:口服急性毒性 LD50＞5 000mg/kg,急性皮膚毒性 2 000mg/kg)、高效和高生物利用率等,使原花青素在食品、醫(yī)藥、化妝品等領域得到了廣泛的應用[2]。尤其是近幾年原花青素抗腫瘤的作用越來越受到人們的關注,據(jù)報道原花青素對皮膚癌、口腔癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、結腸癌等都有一定的預防或治療作用,但單獨應用療效并不理想?；诖宋覀冄芯?GSPE對于肺癌的放療增敏作用,為擴大 GSPE的臨床應用和肺癌的放射增敏治療提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

GSPE:天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司;小牛血清:杭州四季青公司產(chǎn)品;RMPI-1640培養(yǎng)基干粉:GIBCO公司產(chǎn)品;噻唑藍(MTT)和碘化丙啶(PI):SIGMA公司產(chǎn)品。倒置相差顯微鏡:OLYMPUS IX70,OLYMPUS公司產(chǎn)品;BIO-RAD iMark自動酶標儀,日本 BIO-RAD公司;流式細胞儀(FCM):EPICS XL,COULTER公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測 GSPE對 X射線增敏作用 取對數(shù)生長期細胞,0.25%胰酶消化,吹打均勻,計數(shù),稀釋至 5×104個 /ml,細胞懸液以 90μl/孔接種至 96孔板,培養(yǎng)貼壁 24 h后加藥處理。實驗設陰性對照組(細胞懸液 +PBS,用于計算抑制率)、空白對照組(無細胞的 DMEM完全培養(yǎng)液 +PBS,用于消除培養(yǎng)液顏色誤差)、原花青素各劑量組(細胞懸液 +不同濃度的原花青素),原花青素各劑量顏色對照組(無細胞的DMEM完全培養(yǎng)液 +不同濃度的原花青素,用于消除藥物的顏色誤差),10μl/孔加藥,每個濃度設 3復孔。陰性對照組和空白對照組加 pH 6.8的磷酸鹽緩沖液,置培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24 h后進行 X射線照射。照射參數(shù):6 MeV直線加速器下,在 2.5 Gy/min時以不同劑量照射,源皮距為 100 cm。照射結束后繼續(xù)培養(yǎng) 4天,取出每孔中加入 MTT 10μl(5mg/m l),再培養(yǎng) 4 h后,吸去培養(yǎng)液,加入二甲基亞砜(DMSO)150μl,震蕩10min,酶標儀單波長 490 nm測定每孔吸光度值(OD)。按下列公式計算抑制率(IR)。

抑制率(IR,%)=[(陰性A均值 -空白A均值)-(實驗 A均值 -顏色 A均值)]/(陰性 A均值 -空白 A均值)×100%

1.2.2 集落形成法檢測 GSPE對 X射線照射后細胞增殖的抑制作用 對數(shù)生長期的各組細胞,0.25%胰酶消化制備細胞懸液。60 mm培養(yǎng)皿中分別按藥物劑量不同種入不同數(shù)量的細胞。細胞貼壁后,分別給予不同劑量藥物(0、25、100、200 μg/m l)作用 24 h,再給予 0、1、5、9 Gy劑量照射,每組 3個復孔。照射后置37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 8～10天。取出后倒去培養(yǎng)液,PBS漂洗 2次,用醋酸甲醇固定,姬姆薩染色 10min,在解剖鏡下計數(shù)直徑大于 50 m(或含 50個細胞以上)的細胞克隆。按以下公式計算存活分數(shù)。

存活率 =某劑量的集落形成數(shù)/某劑量下種植的細胞數(shù) ×100%

1.2.3 流式細胞儀檢測腫瘤細胞凋亡和細胞周期分布 取對數(shù)生長期細胞,消化,計數(shù),調整細胞濃度至5×105/m L,貼壁 24 h后,對照組加 PBS液,實驗組加入 GSPE,培養(yǎng) 48 h后,X射線照射,照射結束繼續(xù)培養(yǎng) 48 h后收集細胞。1 000 r/min離心 5 min,用冷的PBS洗 2次,棄上清,加入 300μg/mL PBS,制成細胞懸液。將0.7mL預冷的無水乙醇沿管壁分多次加入,4℃固定過夜。上機前用 PBS洗 2次,加入 100μg/m LRNA酶,37℃消化 30min,酶切 RNA;加 50μg/mL碘化丙啶(PI),4℃避光染色。用 200目細胞篩過濾后在流式細胞儀上檢測(激發(fā)波長 488 nm,吸收波長 600 nm)。

1.3 統(tǒng)計方法

MTT各組吸光度值值差異采用單因素方差分析,SPSS 13.0統(tǒng)計軟件。集落形成存活率分析采用單擊多靶模型曲線擬合,graphpad Prism 5.0軟件。用計算機自帶 Multicycle(Phoenix Flow System,San Diego,CA,USA)軟件分析,計算出細胞周期分布和凋亡情況。

2 結果

2.1 MTT檢測 GSPE增敏殺傷作用

檢測不同藥物濃度在不同劑量的 X射線照射下的增敏作用,抑制率結果見表 1。對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析,結果表明:X射線和 GSPE均可顯著影響腫瘤細胞的存活率,并且兩者之間存在協(xié)同關系,統(tǒng)計有顯著性差異(P＜0.01)。

但兩者對細胞殺傷的貢獻不同,為進一步分析兩者之間的相關性,固定其中 1個因素水平即 X射線劑量,研究各濃度藥物的增敏作用。結果表明,在藥物濃度小于 25μg/mL時,藥物對腫瘤細胞沒有殺傷作用,也無增敏作用;藥物濃度 50μg/mL時,藥物對腫瘤細胞無殺傷作用,但有增敏作用;100μg/mL時,藥物對腫瘤細胞有殺傷作用,同時也有增敏作用;大于 200 μg/m L時,藥物對腫瘤細胞的殺傷作用強于 X射線的殺傷,表現(xiàn)為協(xié)同作用。所以 50～100μg/mL可以認為是 GSPE的有效增敏濃度。

表1 MTT檢測GSPE合用X射線對SPC-A-1細胞抑制率±s)

表1 MTT檢測GSPE合用X射線對SPC-A-1細胞抑制率±s)

藥物濃度(μg/m L)X射線劑量(Gy)0 1 3 5 7 9 12.5 0.00±0.35 0.00±2.46 0.00±2.07 0.00±3.44 4.50±6.22 17.36±0.26 25 4.51±0.05 3.32±4.69 2.29±3.80 5.46±1.09 11.36±0.79 25.06±0.05 50 7.57±1.22 14.10±1.26 10.66±2.32 13.76±9.98 21.82±11.30 41.38±1.05 100 24.31±7.53 37.37±2.71 40.48±2.35 35.35±6.02 45.09±3.91 56.55±2.20 200 44.58±2.27 44.68±1.61 53.46±1.73 58.04±1.25 77.47±0.14 75.50±0.31 400 51.57±0.51 54.75±1.77 67.50±1.33 68.41±1.31 86.29±2.73 83.01±0.16 800 55.18±1.24 57.93±2.33 68.42±0.18 71.25±0.03 87.90±1.07 83.05±0.63

2.2 集落形成法研究藥物和 X射線對肺癌細胞的增殖抑制作用結果

腫瘤細胞具有無限增殖的潛力,但以藥物干預或X射線照射后會使部分未立即死亡細胞在繼續(xù)分裂數(shù)代后停止增殖。所以集落形成法觀察細胞的增殖抑制作用,結果見表 2。以“多靶單擊模型”進行曲線擬合,“多靶單擊模型”方程:SF=1-(1-e-D/D0)N,Dq=D0lnN,Dq=lnN/k,其中 SF為存活分數(shù),D為放射劑量(Gy),D0代表平均致死量,Dq代表準域劑量,N為外推數(shù),它是曲線指數(shù)區(qū)存活分數(shù)下降 63%所需的照射劑量,反應不同細胞對射線敏感性和同 1種細胞放射敏感性的變化;存活分數(shù)(SF)的計算方法為:處理組集落形成率/對照組集落形成率。增敏比 SER=單純照射組的 D0/增敏照射組的 D0。通過一系列實際實驗的D和得到的相應的一系列 SF,通過曲線擬合出其中的K和 N這兩個參數(shù),所以 K和 N是通過曲線擬合計算出的數(shù)值,K沒有具體意義,其意義有 D0來表示。其他參數(shù)比如 D0,Dq等都可以根據(jù) K、N兩個參數(shù)求出。集落形成結果表明 GSPE為 100μg/m l對 X射線增敏作用明顯,藥物作用后 D0值降低,表明細胞對 X射線敏感性增加;Dq變小,說明細胞修復亞致死損傷的能力變?nèi)?N值減小則細胞在低劑量區(qū)時對亞致死損傷的耐受性降低,增敏比為 2.56,見表 3。

表2 集落形成法測定藥物和X射線對肺癌細胞的抑制率(%)

表3 100μg/mLGSPE劑量增敏曲線分析

2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡

分別比較空白對照組(0 Gy),單獨 X射線照射組(1 Gy,5Gy)和藥物增敏 X射線組(100μg/m L原花青素 1 Gy,5 Gy)流式細胞術 PI染色圖的差異。我們發(fā)現(xiàn)藥物增敏 X射線組細胞出現(xiàn)了明顯的凋亡峰,提示亞二倍體 DNA含量的細胞數(shù)量明顯增加,細胞凋亡率(28.2%)顯著高于單純照射組(14.9%)及空白對照組(5.3%),見圖 1。藥物增敏 X射線組與對照組及單獨 X射線照射組比較,差異均有非常顯著性意義(P＜0.01)。實驗結果說明:原花青素可以誘導細胞凋亡,并將細胞阻滯于 G1期。

圖1 藥物增敏X射線組對細胞凋亡的影響

3 討論

惡性腫瘤是危害人類生命和健康的 1種嚴重疾病,其中肺癌是導致全球人群死亡數(shù)最多的惡性腫瘤,癌癥的放射治療越來越受到人們的重視。但由于腫瘤異質性的存在,不可避免的存在放射抵抗,使腫瘤對放療的治療反應不一,它是影響放療治療劑量的主要因素之一,也直接影響了腫瘤放療的效果。提高腫瘤的放療敏感性一直是醫(yī)學上的熱點和難點。原花青素(PC)是由不同數(shù)量的兒茶素或表兒茶素縮合而成的一大類酚類化合物,廣泛分布于植物界,許多食品和飲料中都含有豐富的原花青素。近年來的研究顯示,具有極強的抗氧化活性,是 1種很好的氧游離基清除劑和脂質過氧化抑制劑,它還有清除自由基、調節(jié)免疫抗彈性酶,抗誘變等多種藥理活性[3]。除此之外,它可抑制皮膚癌、口腔癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、結腸癌等多種腫瘤細胞的生長,誘導多種腫瘤細胞凋亡[4]。Huyny等[5]發(fā)現(xiàn),用 PC處理的人體乳腺癌細胞中測得的凋亡數(shù)比未處理的同種細胞高的多;而在正常人乳腺細胞樣品中,PC并不明顯改變凋亡的數(shù)量。Shih等[6]研究了原花青素不僅抑制胃腺癌細胞的增殖,而且可以誘導其凋亡。Bomser等[7]研究了抑制誘導的小鼠皮膚腫瘤發(fā)展的活性。有學者研究原花青素對肺癌的治療作用,對肺癌細胞和大鼠多臟器癌癥模型的肺癌均有較好的治療和預防作用,因此,本實驗設計研究 GSPE的放療增敏作用。實驗結果表明 GSPE對肺癌 SPC-A-1細胞有較好的放療增敏作用,增敏劑量在 50～100μg/mL之間,低于該劑量增敏效果不顯著。在增敏劑量下對單獨 X射線照射和藥物作用后 X射線照射細胞存活分數(shù)進行曲線擬合,分析結果表明,GSPE對 X射線有顯著的增敏作用,藥物作用后 D0值降低,表明細胞對 X射線敏感性增加;Dq代表準域劑量,它反映肩區(qū)的大小,表明細胞亞致死損傷修復能力。藥物作用后,Dq變小,說明細胞修復亞致死損傷的能力變?nèi)?N值減小則細胞在低劑量區(qū)時對亞致死損傷的耐受性降低,增敏比為 2.56。既往研究認為,細胞的放射敏感性與細胞凋亡水平有關,細胞凋亡反應越強放射敏感性越高,快速凋亡細胞的放射敏感性最強。流式細胞術(PI染色法)結果發(fā)現(xiàn)原花青素與放療聯(lián)合應用凋亡率較對照組和單純放療組明顯增加,提示原花青素能增強 SPC-A-1細胞對放療誘導凋亡的敏感性,推測這可能與原花青素改變細胞周期的分布有關。在實驗中發(fā)現(xiàn)它能使 G0/G1期細胞比例明顯增加,S期和 G2/M期減少,這樣便相應抑制了腫瘤細胞進入 DNA合成期和有絲分裂期,促進了細胞的凋亡,增加了放療的敏感性。

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