國(guó)建飛,楊立偉,高志明,何 明,白世祥,施 靖

腫瘤的細(xì)胞過(guò)繼免疫治療日益受到重視。成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞 (dendritic cell,DC)是體內(nèi)功能最強(qiáng)的、最有效的抗原遞呈細(xì)胞。腫瘤引流區(qū)淋巴結(jié) (tumor-draining lymph node,TDLN)含有豐富的淋巴細(xì)胞,由于其特殊的位置,又含有較多的已攝取腫瘤抗原的樹(shù)突狀細(xì)胞,TDLN可以成為一種較好獲得的對(duì)腫瘤細(xì)胞有很強(qiáng)殺傷作用的淋巴細(xì)胞潛在來(lái)源。本研究通過(guò)建立人食管癌裸鼠模型,探索 TDLN在體內(nèi)對(duì)食管癌細(xì)胞的殺傷作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí) BALB/C裸鼠 30只,3～4周齡,體質(zhì)量 14～17 g,雄性,購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證明號(hào)是 48678。飼養(yǎng)室內(nèi)恒溫、恒濕,定期紫外線照射,鼠籠、墊料、飲水、飼料均高壓消毒。

1.1.2 腫瘤標(biāo)本 取自河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院胸二科食管中段癌手術(shù)患者,男性,65歲。臨床病理分期:T3N1M0,中分化鱗狀細(xì)胞癌。術(shù)前未行放、化療。

1.1.3 TDLN細(xì)胞 術(shù)中取同一患者 TDLN制成細(xì)胞懸液培養(yǎng)7 d獲得。

1.2 方法

1.2.1 TDLN細(xì)胞的培養(yǎng)和食管癌細(xì)胞抗原的制備 手術(shù)時(shí)無(wú)菌摘取2～3個(gè)無(wú)明顯轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié),用 D-Hank′s液沖洗并去除結(jié)締組織和脂肪組織后,剪成 1mm3大小的組織碎片,200目鋼網(wǎng)過(guò)濾,懸于 30m lRPMI1640培養(yǎng)基。將 TDLN細(xì)胞分為 3組進(jìn)行培養(yǎng),TDLN-Ⅰ組培養(yǎng)基中添加 IL-2,TDLN-Ⅱ組添加 IL-2+IL-4+粒 -單核細(xì)胞集落刺激因子 (GM-CSF),TDLN-Ⅲ組添加 IL-2+IL-4+GM-CSF+自身食管癌細(xì)胞抗原 (tAg),置于 37℃,5%二氧化碳 (CO2)培養(yǎng)箱培養(yǎng),具體方法參見(jiàn)文獻(xiàn) [1]。

1.2.2 人食管癌裸鼠移植瘤模型的建立 手術(shù)時(shí)無(wú)菌切取部分食管癌組織塊,用 0.9%氯化鈉注射液沖洗后切成近 1 mm3大小,植入裸鼠腋背部皮下,具體方法參照文獻(xiàn) [2]。

1.2.3 動(dòng)物模型的分組及處理 依移植瘤體積大小編號(hào),采用隨機(jī)數(shù)字表法將動(dòng)物模型分成 5組:空白對(duì)照組、IL-2組、TDLN-Ⅰ組、TDLN-Ⅱ組、TDLN-Ⅲ組,每組 6只裸鼠。1周后治療 (瘤體大約 30 mm3,淋巴結(jié)細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期):空白對(duì)照組每只裸鼠局部注射 0.9%氯化鈉注射液 0.2 ml;IL-2組每只裸鼠局部注射 1 000 U/ml的 IL-2 0.2 ml;TDLN-Ⅰ組、TDLN-Ⅱ組、TDLN-Ⅲ組每只裸鼠局部注射效應(yīng)細(xì)胞 (TDLN細(xì)胞)2×107/ml0.2ml以及 1 000 U/ml的IL-2 0.2 ml。以后,空白對(duì)照組裸鼠每周局部注射 0.9%氯化鈉注射液 0.2 ml,其他各組裸鼠每 3 d局部注射 1次 IL-2 0.2 ml(1 000 U/m l)。每周用游標(biāo)卡尺測(cè)量并記錄腫瘤長(zhǎng)徑(a)、短徑 (b),按體積 (V)=πab2/6計(jì)算腫瘤體積。根據(jù)腫瘤體積的變化描繪各組的腫瘤生長(zhǎng)曲線,并計(jì)算抑瘤率,抑瘤率 (%)=〔1-(實(shí)驗(yàn)組結(jié)束瘤體積 -實(shí)驗(yàn)組開(kāi)始瘤體積)/(空白對(duì)照組結(jié)束瘤體積 -空白對(duì)照組開(kāi)始瘤體積)〕×100%。5周后脫頸處死裸鼠取出移植瘤標(biāo)本。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)移植瘤的腫瘤細(xì)胞凋亡率 將瘤塊用70%的乙醇固定,制成單細(xì)胞懸液,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡率。具體方法按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s)表示;各組間是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異采用General Linear Model中 Repeated Measures進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn);如有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,每周各組間采用 One-way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 本組 30只裸鼠食管癌移植瘤成活率為 100%。

2.2 裸鼠移植瘤體積變化 General Linear Model分析顯示,實(shí)驗(yàn)的不同時(shí)間 5組裸鼠移植瘤體積變化間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=30.020,P＜0.01);且實(shí)驗(yàn)進(jìn)行 3、4、5周時(shí),TDLN-Ⅰ組、TDLN-Ⅱ組和 TDLN-Ⅲ組裸鼠移植瘤體積與空白對(duì)照組及 IL-2組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01);實(shí)驗(yàn)進(jìn)行 3周及 5周時(shí),TDLN-Ⅲ組裸鼠移植瘤體積較 TDLN-Ⅰ組顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05,見(jiàn)表 1)。

2.3 各組裸鼠的抑瘤率 TDLN各組裸鼠的腫瘤抑瘤率大于IL-2組,且 TDLN-Ⅲ組抑瘤率最高 (見(jiàn)表 2)。

2.4 各組腫瘤細(xì)胞凋亡率比較 空白對(duì)照組、IL-2組、TDLN-Ⅰ組、TDLN-Ⅱ組、TDLN-Ⅲ組腫瘤細(xì)胞凋亡率分別為 (7.1±3.0)%、 (12.4±1.2)%、 (27.6±2.0)%、(33.1±4.5)%和 (39.1±1.5)%,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=153.314,P＜0.01);且各組腫瘤細(xì)胞凋亡率間兩兩比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。

表 1 實(shí)驗(yàn)的不同時(shí)間 5組裸鼠移植瘤體積變化 (±s,mm3)Table 1 The transplantation tumor volume of five groups from week 1 to week 5

表 1 實(shí)驗(yàn)的不同時(shí)間 5組裸鼠移植瘤體積變化 (±s,mm3)Table 1 The transplantation tumor volume of five groups from week 1 to week 5

注:與空白對(duì)照組比較,*P＜0.01;與 IL-2組比較,△P＜0.01;與TDLN-Ⅰ組比較,☆P＜0.05

組別 只數(shù) 1周 2周 3周 4周 5周空白對(duì)照組 6 29.4± 5.0 106.8±22.3 521.0±90.7 759.7±154.8 1172.5±274.8 IL-2組 6 29.9± 4.0 101.7±13.1 513.3±43.6 667.9± 98.1 1057.8±103.1 TDLN-Ⅰ組 6 34.9±14.1 115.1±21.9 312.9±32.0*△ 388.8± 33.6*△ 711.3± 39.6*△TDLN-Ⅱ組 6 30.3± 4.0 103.3±23.6 269.2±35.2*△ 345.5± 21.3*△ 612.3±186.8*△TDLN-Ⅲ組 6 30.4± 3.2 102.0±13.1 240.9±36.3*△☆ 337.0± 27.3*△ 502.1± 90.0*△☆F值.306 P值 0.647 0.737 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 0.628 0.498 40.188 30.082 19

表 2 各組裸鼠抑瘤率(%)Table 2 Inhibition ratio of transplantation tumor of four groups

3 討論

TDLN細(xì)胞含有豐富的淋巴細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞,由于其特殊的位置,淋巴細(xì)胞受到樹(shù)突狀細(xì)胞遞呈的腫瘤抗原致敏,對(duì)腫瘤細(xì)胞具有特異性殺傷作用[3]。但在患者體內(nèi),腫瘤細(xì)胞通過(guò)免疫抑制和免疫逃逸機(jī)制[4],致使腫瘤抗原不能得到有效的提呈,T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答不能被有效激活[5]。

本實(shí)驗(yàn)采取體外培養(yǎng) TDLN細(xì)胞的方法,消除免疫抑制性細(xì)胞因子的影響,使樹(shù)突狀細(xì)胞能夠有效地遞呈抗原,T淋巴細(xì)胞能夠被有效地激活,主要通過(guò) CD+8T細(xì)胞的分泌型殺傷作用和非分泌型殺傷作用殺傷腫瘤細(xì)胞。另外,TDLN細(xì)胞中的CD+56細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞具有非特異性殺傷作用。

TDLN細(xì)胞容易獲得,手術(shù)時(shí)摘取即可,不需要從外周血或腫瘤組織中提取,而且 TDLN內(nèi)淋巴細(xì)胞含量豐富,經(jīng)培養(yǎng)完全能達(dá)到臨床使用的數(shù)量,不像淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(LAK細(xì)胞)和腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞 (TIL)提取獲得的增殖細(xì)胞數(shù)量較少,同時(shí)它還含有較多的已攝取腫瘤抗原的樹(shù)突狀細(xì)胞及少量自然殺傷細(xì)胞 (NK細(xì)胞)等。食管癌 TDLN細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)后可以得到大量 T細(xì)胞和成熟樹(shù)突狀細(xì)胞,IL-2是淋巴細(xì)胞體外增殖的必備條件[6],在培養(yǎng)基中添加 GM-CSF和 IL-4能得到更多的成熟樹(shù)突狀細(xì)胞[6-7]。有人認(rèn)為自體腫瘤抗原致敏的樹(shù)突狀細(xì)胞,和 TDLN細(xì)胞共同培養(yǎng)后,具有更強(qiáng)的殺傷作用[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,TDLN-Ⅲ組與 TDLN-Ⅱ組裸鼠移植瘤體積以及抑瘤率間無(wú)顯著差異,說(shuō)明 TDLN中的樹(shù)突狀細(xì)胞已獲取腫瘤抗原,無(wú)需再次致敏,體外培養(yǎng)完全可以使其恢復(fù)活性。

本研究結(jié)果還顯示,TDLN-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組腫瘤細(xì)胞凋亡率均顯著高于 IL-2組和空白對(duì)照組,表明 TDLN細(xì)胞可促進(jìn)食管癌細(xì)胞凋亡,其中 TDLN-Ⅲ組腫瘤細(xì)胞凋亡率最高,TDLN-Ⅱ組次之,TDLN-Ⅰ組最低,表明經(jīng)自身腫瘤抗原刺激后,TDLN細(xì)胞具有更強(qiáng)的促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。

綜上所述,TDLN細(xì)胞在體外培養(yǎng)后回輸體內(nèi)可以獲得有效殺傷腫瘤細(xì)胞的作用;TDLN細(xì)胞能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。TDLN細(xì)胞由個(gè)體腫瘤直接致敏,具有特異性,培養(yǎng) TDLN細(xì)胞回輸人體有可能作為一種有效的個(gè)體化抗腫瘤免疫治療新方法。但 TDLN細(xì)胞是通過(guò)何種途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的,尚待進(jìn)一步研究。

1 李啟亮,單保恩,張超,等.不同刺激劑誘導(dǎo)肺癌患者引流淋巴結(jié)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的研究 [J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2006,22(5):609-612.

2 何明,單報(bào)恩,李啟亮,等.肺癌淋巴結(jié)細(xì)胞培養(yǎng)及體內(nèi)外的殺傷作用 [J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2006,23(3):359-361.

3 Carriere V,Coliddon R,Jiguet-Jiglaire C,et al.Cancer cells regulate lymphocyte recruitment and leukocyte-endothelium interactions in the tumor-draining lymph node[J].Cancer Res,2005,65(24):11639-11648.

4 Kacani L,Wurm M,Schennach H,et al.Immuno-suppressive effects ofsoluble factorssecreted by head and neck squamous cell carcinoma on dendritic cells and T lymphocytes[J].Oral Oncol,2003,39(7):672-679.

5 Cohen PA,Peng L,Kjaergaard J,et al.T-cell adoptive therapy of tumors:mechanisms of improved therapeutic performance[J].Crit Rev Immunol,2001,21(13):215-248.

6 金鷹,唐玫,李國(guó)明 .實(shí)用淋巴細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) [J].激光生物學(xué)報(bào),2000,9(3):75-78.

7 李秋平.細(xì)胞因子與樹(shù)突狀細(xì)胞分化誘導(dǎo) [J].外醫(yī)學(xué)腫瘤學(xué)分冊(cè),2004,31(10):742-744.

8 Sabel MS,Arora A,Su G,et al.Adoptive immunotherapy of breast cancer with lymph node cells primed by cryoablation of theprimary tumor[J].Cryobiology,2006,53(3):360-366.