高佩安 張 苗 魏成芳

(1泰山醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室， 山東 泰安 271000；2泰山醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院2006級(jí)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)本科，山東 泰安 271016；3泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東 泰安 271000)

胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ESC )是由著床前囊胚期內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass，ICM)或早期胚胎原始生殖嵴的胚胎生殖細(xì)胞(primordial gerrn cells，PGCs)建立的、可在體外未分化狀態(tài)下長(zhǎng)期增殖傳代的、具有穩(wěn)定的二倍體核型、具有自我更新和多向分化增殖潛能的全能干細(xì)胞，表面特異抗原標(biāo)記的、可分化為三個(gè)胚層來(lái)源的各種組織和細(xì)胞類型(包括生殖腺和生殖細(xì)胞)的永久細(xì)胞系。美國(guó)科學(xué)家James Thomo-son 和John Gearhart分別用ESC和胚胎生殖細(xì)胞建立了胚胎干細(xì)胞系，為研究ESC的發(fā)育和利用其治療疾病提供了新的空間[1-2]。目前普遍認(rèn)為，ESC對(duì)體外研究動(dòng)物和人胚胎的發(fā)生發(fā)育，新基因的發(fā)現(xiàn)，藥物的篩選和致畸實(shí)驗(yàn)及作為細(xì)胞組織移植治療，克隆治療和基因治療的細(xì)胞源及產(chǎn)生克隆和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等領(lǐng)域?qū)a(chǎn)生重要的影響。ESC成為21世紀(jì)生命科學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一，現(xiàn)就ESC的特性以及其應(yīng)用作一綜述。

1 ESC的基本概念

ESC 一般是指由著床前胚泡內(nèi)細(xì)胞團(tuán)經(jīng)體外抑制分化培養(yǎng)分離出來(lái)的具有多能性或全能性的細(xì)胞。ESC是由 Evans和 Kaufman[3]1981年首次從延遲植入小鼠囊胚中分離出來(lái)的多能性細(xì)胞，當(dāng)時(shí)取其名字首字母而稱之為 EKC,以后均改稱為 ESC。

2 ESC的特性

2.1全能性 ESC具有發(fā)育的全能性(totipotencv)，即在解除分化抑制劑條件下，具有發(fā)育成為機(jī)體的不同細(xì)胞類型的任何一種和形成多種組織的能力[5]。在體外，ESC可被誘導(dǎo)分化出包括三個(gè)胚層在內(nèi)的所有分化細(xì)胞。若將ESC注射到SCID小鼠或同源動(dòng)物體內(nèi)，可分化產(chǎn)生出三個(gè)胚層細(xì)胞組織構(gòu)成的畸胎瘤。ESC也具有種系傳遞功能，能與另一正常胚胎嵌合，獲得包括生殖系在內(nèi)的動(dòng)物個(gè)體。全能性是ESC具有可塑性的基礎(chǔ)，也是ESC優(yōu)于成年組織干細(xì)胞的重要特點(diǎn)。

2.2體外分化 在特定的體外培養(yǎng)條件下，ESC也能分化形成各種細(xì)胞系，如造血細(xì)胞、肌肉細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等。ESC體外分化途徑和機(jī)制與在體胚胎細(xì)胞不完全相同，但在分子水平上仍有許多相似之處，因而可將其作為研究各種類型體細(xì)胞決定與分化機(jī)理等發(fā)育生物學(xué)問(wèn)題的新穎的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚6]，與傳統(tǒng)的整體胚胎的研究相比，體外ESC具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：(1)ESC在體外可分化形成各種終末細(xì)胞, 這為研究某些前體細(xì)胞的起源和特性提供了理想的實(shí)驗(yàn)體系；(2)體外培養(yǎng)能定性與定量地研究某些細(xì)胞因子，胞外基質(zhì)等因素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的影響，避免和減少了整體胚胎研究中各種內(nèi)源性因素干擾的復(fù)雜性；(3)在研究胚胎早期發(fā)育中某些必需基因的功能時(shí)，在體胚胎的這些基因常發(fā)生突變引起胚胎過(guò)早的在子宮中死亡，而在體外這些基因突變的ESC仍保持存活、增殖和分化的潛能，參與胚胎發(fā)育[7]，因此為研究這些基因在胚胎發(fā)育中的功能提供了基本條件。

2.3遺傳穩(wěn)定性 ESC在分化的過(guò)程中，可以完整地體現(xiàn)原有的生理特點(diǎn)和結(jié)構(gòu)組成，即基因能夠得到完全的表達(dá),具有穩(wěn)定的遺傳性能，因此在骨髓移植、肌肉和皮膚等的修復(fù)等醫(yī)學(xué)方面具有廣闊的前景[7], 也可在體外對(duì) ESC進(jìn)行遺傳操作選擇，如誘導(dǎo)外源基因、標(biāo)志基因等制作嵌合體，通常不會(huì)改變選擇后的ESC本身的遺傳性能，所以在理論上經(jīng)遺傳操作后的ESC仍能保持其擴(kuò)增、發(fā)育的全能性的穩(wěn)定遺傳[8]，這就可以根據(jù)這種性能制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物個(gè)體或基因缺失、突變或過(guò)量表達(dá)的雜合或純合個(gè)體，以便分析各種基因功能和基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制等。

2.4其他特性 ESC有正常的二倍體核型，染色質(zhì)多為常染色質(zhì)。光鏡下人ESC小、核大、核質(zhì)比高，有一個(gè)或多個(gè)核仁。電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)人ESC為不均質(zhì)的細(xì)胞，大多數(shù)細(xì)胞形成緊密的球形克隆，外圍是上皮樣細(xì)胞[9]。未分化的ESC表達(dá)階段特異性胚胎抗原 (stage-specific embryonic antigens，SSEA)SSEA-3、SSEA-4和腫瘤排斥抗原(tumor rejection antigen， TRA)TRA-1-60，TRA-1-81和 TRA-2-54[10]。轉(zhuǎn)錄因子 Oct-3、Oct-4在未分化的 ESC中呈陽(yáng)性表達(dá)，Oct-3、Oct-4是 POU同源結(jié)構(gòu)域家族成員，在胚胎發(fā)育過(guò)程中起著重要作用，被認(rèn)為是 ESC多能性的標(biāo)志。ESC同時(shí)表達(dá)堿性磷酸酶和具有高度端粒酶活性，大多數(shù)體細(xì)胞的端粒酶活性不高，并在 50～80 代有限增殖后進(jìn)入老化階段，ESC則表達(dá)高端粒酶活性，即使培養(yǎng)1年，傳代300代仍具有高端粒酶活性。

3 ESC的分離培養(yǎng)與鑒定

由于ESC具有向多種細(xì)胞分化的特性及自我復(fù)制的特性，因此其培養(yǎng)應(yīng)保持自我復(fù)制功能，同時(shí)還要保持未分化狀態(tài)。①ESC體外培養(yǎng)條件：由于 ESC來(lái)源于分裂增殖非?；钴S的早期胚胎細(xì)胞，維持其生長(zhǎng)代謝所需的營(yíng)養(yǎng)要充足，所以其培養(yǎng)液需為高糖并含谷氨酰胺,同時(shí)加胎牛血清、2-巰基乙醇等。由于 ESC生長(zhǎng)速度快，消耗的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)多，培養(yǎng)時(shí)需注意。為防止自發(fā)分化，傳代密度應(yīng)相對(duì)高，密度太小或飼養(yǎng)層質(zhì)量太差均可使 ESC生長(zhǎng)停滯，另外不要使培養(yǎng)液過(guò)度成酸性[11]。②保持 ESC的多潛能性，最大限度地抑制其分化。目前常用的分化抑制物有飼養(yǎng)層、條件培養(yǎng)基和分化抑制因子。曾秋棠等[12]表明BRL條件培養(yǎng)基完全可以代替重組白血病抑制因子(rLIF)。人胚胎成纖維細(xì)胞完全可以代替小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，在培養(yǎng)液中含有 hLIF條件下可以支持 hESC體外長(zhǎng)期培養(yǎng)[13]。有學(xué)者[11]采用無(wú)飼養(yǎng)層的方法進(jìn)行培養(yǎng)，其優(yōu)點(diǎn)能排除處理飼養(yǎng)層細(xì)胞時(shí)所用絲裂霉素對(duì) ESC的毒性作用。都同功等[14]運(yùn)用 KNOCKOUT SR和 KNOCKOUT DMEM培養(yǎng)液分別代替 FBS和 DMEM，不僅在有飼養(yǎng)層上，而且在加上 LIF的無(wú)飼養(yǎng)層來(lái)培養(yǎng) ESC均能保持 ESC呈未分化狀態(tài)。③ESC的鑒定：形態(tài)鑒定。體外培養(yǎng)細(xì)胞呈小集落、貼壁生長(zhǎng)，集落邊緣清晰、光滑，細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞間界限不清；消化后的單個(gè)ESC 小、亮、圓形，邊界清，胞漿少，細(xì)胞核大，核仁明顯，有 1～2個(gè)核仁，核型鑒定，正常的二倍體核型特征是 ESC全能性的基礎(chǔ)。分化潛能檢測(cè)(包括分化實(shí)驗(yàn)和嵌合體實(shí)驗(yàn))：體外 分化實(shí)驗(yàn)將ESC消化離散制成懸液(1×106/ml)培養(yǎng)于鋪有明膠的培養(yǎng)皿中，每 2天換 1次液 ，觀察其分化結(jié)果；體內(nèi)分化實(shí)驗(yàn)：將 ESC離散 制成懸液，以適當(dāng)劑量注射到同源動(dòng)物的皮下，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間即可形成混合組織瘤。手術(shù)取瘤，常規(guī)方法制成組織切片，染色并觀察分化結(jié)果；嵌合體實(shí)驗(yàn)：通過(guò)聚合法或顯微注射法，使ESC與宿主胚胎細(xì)胞共同發(fā)育并產(chǎn)生個(gè)體。然后通過(guò)檢測(cè) ESC在嵌合體中的表達(dá)，確定其全能性或多能性。免疫組織化學(xué)檢測(cè)，比較常用的有堿性磷酸酶(AKP)和胚胎階段特異性抗原免疫熒光標(biāo)記。ESC在傳代過(guò)程中始終保持胚胎干細(xì)胞性的特征，如 AKP染色陽(yáng)性、干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子OCT-4陽(yáng)性表達(dá)或者高端粒酶活性等；免疫組織化學(xué)、組織化學(xué)和免疫熒光標(biāo)記，以檢測(cè)ESC表面標(biāo)志性抗原SSEA-1，SSEA-3和 ALP等的表達(dá)情況[15]。

4 ESC的臨床應(yīng)用

4.1研究人胚胎發(fā)育早期疾病 人的ESC可用于研究人胚胎發(fā)育早期的一些疾病，如出生缺陷，胎盤(pán)異常引起的自發(fā)流產(chǎn)。也能夠用來(lái)探索胚胎早期發(fā)育過(guò)程中染色體發(fā)生畸變的影響因素，這使我們能夠檢測(cè)兒童早期腫瘤的發(fā)生。

4.2用于癌癥的治療 癌癥患者的造血功能由于化學(xué)藥物治療和放射線治療受到嚴(yán)重?fù)p傷，如果完全依靠自身是難以恢復(fù)機(jī)體全部免疫功能的，而免疫功能對(duì)于癌癥患者的治療來(lái)說(shuō)非常重要，從這種意義上講，將誘導(dǎo)分化后的ESC移植給接受大劑量放療和化療的患者，有望恢復(fù)其造血和免疫功能，這為癌癥的治療帶來(lái)了新的突破[16]。

4.3可以分化為神經(jīng)細(xì)胞 有學(xué)者在體外將ESC誘導(dǎo)分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的前體，然后將其植入人類脫髓鞘病變模型的大鼠體內(nèi)，結(jié)果顯示ESC源性的前體細(xì)胞可與宿主神經(jīng)元建立聯(lián)系并在脊髓和大腦內(nèi)形成軸突髓鞘。Lee等[17-18]報(bào)道了培養(yǎng)誘導(dǎo)ESC分化成為神經(jīng)元的5步法。Lenka等[19]則發(fā)現(xiàn)ESC在一定的誘導(dǎo)條件和時(shí)間下，可分化為NSC形態(tài)的神經(jīng)細(xì)胞。經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)和RT-PCR檢測(cè)證實(shí)，該神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)巢蛋白、膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)。Tropel等[20]將25 μg/L 的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)添加入達(dá)爾貝科極限必需培養(yǎng)液/F-l2培養(yǎng)液中，以誘導(dǎo)鼠ESC向神經(jīng)細(xì)胞分化。結(jié)果在誘導(dǎo)7天后，通過(guò)細(xì)胞形態(tài)分析以及免疫熒光、RT-PCR和鈣離子通道等檢測(cè)證明，鼠ESC在一定質(zhì)量濃度的bFGF和特定的培養(yǎng)條件下，經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)后能夠表現(xiàn)出早期神經(jīng)細(xì)胞的功能與特性。

4.4可以分化為心肌細(xì)胞 ESC定向分化為心肌細(xì)胞的誘導(dǎo)因素有：(1)化學(xué)誘導(dǎo)劑如維甲酸(RA)、二甲基亞砜(DMSO)和5-氮雜胞苷等在體外可誘導(dǎo)Es細(xì)胞向心肌細(xì)胞的定向分化。(2)細(xì)胞因子:眾多細(xì)胞因子參與調(diào)控ESC向心肌譜系的提交和分化，如骨形態(tài)生成蛋白(BMP)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)和具有表皮生長(zhǎng)因子受體樣結(jié)構(gòu)的Cfipto-1等。此外，胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)和促紅細(xì)胞生成素(EPO)等也可誘導(dǎo)ESC向心肌細(xì)胞的定向分化。王治等[21]研究發(fā)現(xiàn)，外源性促紅細(xì)胞生成素早期干預(yù)能夠通過(guò)上調(diào)GATA-4、Nkx2．5mRNA的表達(dá)，促進(jìn)ESC向心肌細(xì)胞的分化。(3)轉(zhuǎn)錄因子:在干細(xì)胞向心肌譜系的提交分化過(guò)程中，早期心肌轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控著心肌特異性基因和蛋白的表達(dá)，啟動(dòng)干細(xì)胞的心肌終末分化。早期心肌轉(zhuǎn)錄因子如Nkx2.5 、Tbx5、 GATA-4 、GATA-5 、GATA-6 、Mef2c、Myocardin A和HAND等相互協(xié)同，調(diào)控心肌特異性基因和蛋白的表達(dá)，啟動(dòng)ESC的心肌終末分化。GATA-5、GATA-6和GATA-4一起表達(dá)于心前區(qū)中胚層，也可促進(jìn)心肌細(xì)胞分化或補(bǔ)充GATA-4的缺失[22]。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1(NRG-1)對(duì)Nkx2．5和GATA-4的表達(dá)具有正向調(diào)節(jié)作用，能夠促進(jìn)ESC向心肌細(xì)胞的分化[23-24]。Tbx5初始表達(dá)于線性心管，后局限表達(dá)于心房和左心室，在心內(nèi)膜與心肌發(fā)育過(guò)程中與GATA-4、GATA-6協(xié)同發(fā)揮作用[25]。Mef2c可激活心臟結(jié)構(gòu)基因，參與早期心管的形成和心室肌的分化，Myocardin A是一類核蛋白，屬于SAP家族，在調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞成熟中發(fā)揮重要作用[26]。HAND可與GATA-4協(xié)同激活心肌特異性終末分化基因ANF、BNP和a-MHC等基因的表達(dá)，調(diào)控ESC向心肌細(xì)胞進(jìn)行分化[27]。

4.5ESC在眼科中的應(yīng)用 (1)ESC與視網(wǎng)膜疾病: Lamba等[28]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)ESC可被直接誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜細(xì)胞及視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞，誘導(dǎo)分化的視網(wǎng)膜細(xì)胞移植后能整合進(jìn)視網(wǎng)膜，并表達(dá)光感受器細(xì)胞標(biāo)記。Osakada等[29]在體外成功誘導(dǎo)hESC高效分化為多角形RPE，同時(shí)向培養(yǎng)液中添加bFGF、?；撬岷途S生素A酸，產(chǎn)生了大量的視錐細(xì)胞和視桿細(xì)胞。此研究為治療視網(wǎng)膜變性疾病，如黃斑變性或色素性視網(wǎng)膜炎提供了一種可能的途徑。(2)ESC與角膜損傷: 人的角膜自我更新由位于角膜緣外圍區(qū)域的角膜緣干細(xì)胞來(lái)維持。角膜緣干細(xì)胞的維持依靠其角膜緣微環(huán)境，包括基質(zhì)中的Ⅳ 型膠原蛋白和間質(zhì)中的角膜緣成纖維細(xì)胞。Homma等[30]將小鼠ESC誘導(dǎo)分化為角膜上皮細(xì)胞，并移植到角膜損傷小鼠身上，24 h內(nèi)角膜上皮再生，表達(dá)特異性標(biāo)志物，且沒(méi)有形成畸胎瘤。Ahmad等[31]以Ⅳ型膠原蛋白鋪板，用角膜緣成纖維細(xì)胞CM培養(yǎng)hESC，誘導(dǎo)分化為角膜和皮膚上皮樣細(xì)胞。以上研究表明將ESC誘導(dǎo)分化為角膜上皮細(xì)胞有可能為臨床角膜移植提供一種無(wú)限的供體來(lái)源。

4.6用于糖尿病的治療 由于糖尿病的發(fā)病機(jī)制不清楚，目前仍缺乏有效的根治方法。人胚胎干細(xì)胞可定向分化為胰島細(xì)胞，為醫(yī)學(xué)界和已經(jīng)喪失胰島功能的糖尿病患者帶來(lái)了新的希望[32]。

4.7用于燒傷和創(chuàng)傷的治療 目前臨床上對(duì)燒傷或創(chuàng)傷患者進(jìn)行整形修復(fù)時(shí)主要是依靠自身皮膚的移植，但對(duì)于大面積嚴(yán)重?zé)齻驌p傷的患者根本無(wú)法移植，只能讓患者形成永久性疤痕。ESC可以誘導(dǎo)分化為表皮干細(xì)胞，可以移植到患者皮膚進(jìn)行修復(fù)。

4.8維持基因組穩(wěn)定性 DNA是細(xì)胞生命活動(dòng)的重要遺傳物質(zhì)，保持其分子結(jié)構(gòu)的完整性和穩(wěn)定性對(duì)于細(xì)胞存活及正常生理功能的發(fā)揮具有重要意義。ESC可通過(guò)DNA修復(fù)機(jī)制、細(xì)胞凋亡程序或細(xì)胞分化去除受損細(xì)胞，以維持基因組穩(wěn)定[33]。

4.9應(yīng)用于克隆技術(shù) 新加坡國(guó)立大學(xué)生物系教授洪云漢及2名中國(guó)助手組成的研究小組，以青亙粹魚(yú)為模式動(dòng)物，成功培育出單倍體胚胎干細(xì)胞系，并將該單倍體胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞核移植到正常的未受精卵細(xì)胞中，培育出一條名叫“霍莉”的半克隆魚(yú)。

4.10其他用途 ESC還可以用于基因治療和基因功能分析、新藥研制和開(kāi)發(fā)、肝臟等疾病的治療、產(chǎn)生稀有蛋白從而研究這些蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能等方面。

隨著近年來(lái)對(duì)ESC 的研究發(fā)展，人們對(duì)維持ESC未分化狀態(tài)的調(diào)控機(jī)理和向特定細(xì)胞類型分化機(jī)制的認(rèn)識(shí)不斷深入，對(duì)ESC分化的細(xì)胞的功能特征有了更多的了解，ESC的研究為我們展示了生命科學(xué)和人類醫(yī)學(xué)的美妙藍(lán)圖，但在實(shí)際操作和將來(lái)應(yīng)用上尚存在許多技術(shù)難題和疑問(wèn)，比如移植排斥問(wèn)題，如何定向誘導(dǎo)干細(xì)胞的分化，以及由ESC研究引發(fā)的設(shè)計(jì)倫理、社會(huì)、法律、醫(yī)學(xué)、神學(xué)和道德等爭(zhēng)議也限制了當(dāng)前ESC的發(fā)展等問(wèn)題。盡管干細(xì)胞研究仍面臨著一些困難，但其巨大應(yīng)用價(jià)值是有目共睹的，隨著基礎(chǔ)研究的不斷深入，必將在再生醫(yī)學(xué)、人早期胚胎發(fā)育、治療性藥物篩選、基因治療中有著廣泛的應(yīng)用前景。

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