張小剛,鐘 理*,劉 青,王建飛,王 皓,葛 昆,秦向東

(1河北大學(xué),河北保定 071002；2保定市第三醫(yī)院)

分泌型蛋白 Dickkopf-1(DKK1)是 Wnt信號通路中重要的調(diào)節(jié)因子。研究發(fā)現(xiàn),其在肺癌、食管鱗癌、肝癌中表達量明顯升高,在結(jié)直腸癌中則明顯下降。2007年 3月 ～2009年 6月,我們觀察了胃癌患者癌組織及血清中 DKK1的表達情況,旨在探討DKK1在胃癌診斷中的價值。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇河北大學(xué)附屬醫(yī)院手術(shù)切除胃癌標本 25份,患者均為男性；年齡 49～76歲,中位年齡 63.5歲。術(shù)前未接受放、化療。另選 15份胃癌患者的癌旁組織(距離組織 ＞1 cm),患者均為男性；年齡 54～72歲,中位年齡 63.5歲。選擇保定市腫瘤醫(yī)院和河北大學(xué)附屬醫(yī)院制備的胃癌患者血清34份 ,患者男 23例,女 11例；年齡 28～87歲 ,中位年齡 65歲；抽血前均未經(jīng)過手術(shù)切除和放、化療,另選健康人血清 38例,男 25例,女 13例；年齡 22～75歲,中位年齡 62.5歲。

1.2 組織 DKK1表達檢測

1.2.1 DKK1 mRNA表達檢測 采用 RT-PCR法:組織標本獲得后立即置于 RNA Later試劑中,-20℃保存?zhèn)溆谩rizol法分別提取 25份癌組織及 15份癌旁組織的總 RNA,以 Oligo(d T)15和反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV對其進行反轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA,所有樣本按照相同步驟操作。設(shè)計合成 PCR反應(yīng)引物,ACTB基因為內(nèi)參。PCR反應(yīng)體系為 25μl,其中包含 cDNA模板 1μl,上下游引物各 1μl,Taq DNA聚合酶 1 U。PCR條件為 95℃ 15 min,94℃ 45 s,55℃ 45 s,72℃ 1 min,72℃延伸 10 min。DKK1基因擴增 35個循環(huán),ACTB基因擴增 24個循環(huán)。擴增產(chǎn)物 2%瓊脂糖凝膠電泳,EB染色,凝膠成像系統(tǒng)照相后用Quantity One軟件進行圖像掃描獲得條帶光密度值。DKK1基因與 ACTB基因條帶光密度值比值為DKK1 mRNA表達量,進行半定量分析。

1.2.2 DKK1蛋白檢測 采用 Western blot法:用RIPA裂解液抽提 17份胃癌及 15份癌旁組織總蛋白(另外 8份胃癌組織在進行 DKK1 mRNA表達水平檢測時用完),變性后進行 SDS-PAGE電泳(5%濃縮膠,10%分離膠),將條帶電轉(zhuǎn)到 NC膜。膜經(jīng)含 5%脫脂奶粉的 0.05%TBST室溫封閉 2 h后與一抗(兔抗人 DKK1抗體和兔抗人 ACTB抗體)4℃反應(yīng)過夜,經(jīng) TBST洗滌 4次(每次 5 min)后與辣根過氧化物酶(HRP)標記抗兔抗體室溫反應(yīng) 1 h,再經(jīng) TBST洗滌 5次(每次 5 min)后用 ECL增強型發(fā)光底物進行顯色,暗室曝光 X光片,顯影定影,光片掃描后用 Quantity One軟件分析獲得條帶光密度值,DKK1蛋白與 ACTB蛋白條帶光密度值比值為DKK1蛋白表達量。

1.3 血清 DKK1檢測 采用 ELISA法。ELISA檢測系統(tǒng)為 R＆D公司的 DY1906試劑盒,按說明書要求操作。鼠抗人 DKK1抗體濃度 4.0μg/ml包被 96孔板,4℃過夜,1%BSA室溫封閉1 h。34份胃癌和38份健康人血清樣本加樣前均進行 3倍稀釋,每個樣品做復(fù)孔,體系 100μl,同時用標準品 DKK1蛋白做倍比稀釋構(gòu)建標準曲線,每個標準品做復(fù)孔,室溫反應(yīng) 2 h。再加入生物素標記的羊抗人 DKK1抗體50 ng/ml室溫反應(yīng) 2 h后用 1∶200稀釋的親合素標記的 HRP室溫避光反應(yīng) 20 min。TMB室溫避光顯色 20 min,終止反應(yīng)后酶標儀讀取各孔雙波長 450 nm處 OD值。所得數(shù)據(jù)繪制 ROC曲線確定 DKK1的閾值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS 16.0統(tǒng)計軟件,所得數(shù)據(jù)用±s表示,組間差異用 Mann-Whitney U檢驗進行分析,檢驗水準 α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 組織 DKK1表達 癌旁組織中 DKK1 mRNA與蛋白表達水平分別為(0.309 6±0.143 7)和(0.620 1±0.273 4)。與癌旁組織相比,24%(6/25)的胃癌組織 DKK1 mRNA表達上調(diào),4%(1/25)的胃癌組織中 DKK1 mRNA表達下降,P均 ＜0.05,72%胃癌組織 DKK1 mRNA表達與癌旁組織無顯著差異；5.88%(1/17)的胃癌組織 DKK1蛋白表達上調(diào),11.76%(2/17)的胃癌組織中 DKK1蛋白表達下降,P均 ＜0.05,82.36%胃癌組織 DKK1蛋白表達與癌旁組織無顯著差異。

2.2 血清 DKK1蛋白水平 胃癌及健康人血清中DKK1蛋白含量分別為(4.471±0.763 0)、(5.015±0.240 6)μg/L,P＜0.01；當確定 DKK1水平閾值為 3.539 0μg/L時,有 61.8%的胃癌患者血清DKK1含量低于此值,15.8%的正常人血清含量低于此值,其診斷敏感性為 61.8%,特異性為 84.2%。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn),DKK1在多種腫瘤中表達異常,但胃癌中結(jié)論尚不一致。本結(jié)果顯示,與癌旁組織相比,部分胃癌組織中 DKK1 mRNA和蛋白表達下降,部分胃癌組織中表達上調(diào)。分析胃癌 DKK1表達下降可能與 DKK1基因在胃癌中甲基化有關(guān)。基因啟動子區(qū)域甲基化會影響基因表達。Sato等[1]發(fā)現(xiàn),DKK1基因在胃腫瘤細胞株和組織中廣泛存在甲基化現(xiàn)象；Maehata等用 DNA去甲基化試劑處理胃癌腫瘤細胞株后,DKK1基因的表達量恢復(fù)至正常水平,此為這一解釋提供了依據(jù)。DKK1表達上調(diào)的原因可能為 Wnt通路本身通過 β-catenin誘導(dǎo)DKK1表達對其自身進行負反饋調(diào)節(jié)；野生型p53[2]、糖皮質(zhì)激素[3]、孕激素[4]、DNA損傷[5]等均誘導(dǎo) DKK1異常表達,具體原因還需更進一步研究。

本研究還發(fā)現(xiàn),胃癌患者血清中 DKK1含量明顯低于健康人,此與組織中的研究結(jié)果不完全一致。原因為組織研究中以癌旁組織為對照組,而血清學(xué)檢測的對照組為正常人血清；二者基因的表達情況有所不同。李靜等[6]發(fā)現(xiàn),STAT3基因在人胃癌及癌旁組織中表達無顯著差異,但與正常胃組織相比卻明顯高表達(P＜0.01)；p53 mRNA在胃癌及癌旁組織中的表達均低于正常胃組織(P＜0.01)。DKK1的表達特點與此類似。同時我們猜測胃上皮分泌細胞及腺細胞的癌化可能影響了細胞的分泌功能,從而降低了癌癥患者血清中 DKK1含量。我們觀察到部分胃癌組織中 DKK1表達量上升,而部分胃癌組織中表達量下降,提示 DKK1與胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系可能更為復(fù)雜,其表達水平的改變可能對腫瘤組織分型、TNM分期、淋巴結(jié)和血源性轉(zhuǎn)移等胃癌病理指標更加敏感,從而在不同階段通過對經(jīng)典或非經(jīng)典的 Wnt信號通路的主次調(diào)節(jié)而在胃癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用,確切解釋還需要更大量分期明確的組織樣本進行更深入的研究。而胃癌患者血清中 DKK1含量明顯降低提示其可能作為胃癌診斷的一項血清學(xué)指標,今后我們將用更多的早期胃癌血清樣品做進一步驗證,以確定其在早期胃癌診斷中的價值。

分析本研究結(jié)果,胃癌患者血清 DKK1水平明顯降低,DKK1有可能作為胃癌的一個新的血清學(xué)診斷指標,但需更大的樣本進一步驗證。

[1]Sato H,Suzuki H,Toyota M,et al.Frequent epigenetic inactivation of Dickkopf family genes in human gastrointestinal tumors[J].Carcinogenesis,2007,28(12):2459-2466.

[2]Wang J,Shou J,Chen X.Dickkopf-1,an inhibitor of the Wnt signaling pathway,is induced by p53[J].Oncogene,2000,19(14):1843-1848.

[3]Ohnaka K,Taniguchi H,Kawate H,et al.Glucocorticoid enhances the expression of dickkopf-1 in human osteoblasts:novel mechanism of glucocorticoid-induced osteoporosis[J].Biochem Biophys Res Commun,2004,318(1):259-264.

[4]Wang FS,Ko JY,Lin CL,et al.Knocking down Dickkopf-1 alleviates estrogen deficiency induction of bone loss.A histomorphological study in ovariectomized rats[J].Bone,2007,40(2):485-492.

[5]Shou J,Ali-Osman F,Multani AS,et al.Human Dkk1,a gene encoding a Wnt antagonist,responds to DNA damage and its overexpression sensitizes brain tumor cells to apoptosis following alkylation damage of DNA[J].Oncogene,2002,21(6):878-889.

[6]李靜,樸云峰,安鼎偉,等.STAT3及相關(guān)生長調(diào)控基因在胃癌組織中的表達及意義[J].中國老年學(xué)雜志,2008,28(3):269-271.