牛奶過敏是嬰幼兒最常見食物過敏反應(yīng)之一，在歐美發(fā)達(dá)國家，嬰兒牛奶過敏發(fā)生率約為2%～7.5%[1]。牛奶過敏是由乳及乳制品中的過敏原蛋白引起的一種變態(tài)反應(yīng)，目前普遍認(rèn)為酪蛋白和β-乳球蛋白是主要的過敏原。αs1-酪蛋白是酪蛋白中最主要的一個過敏原，凡是對酪蛋白過敏的人，基本上都對αs1-酪蛋白過敏[2]。

蛋白質(zhì)引發(fā)食物過敏反應(yīng)的免疫學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)就是過敏原表位，即過敏原中參與結(jié)合抗體的組成部分。不同類型的表位在食物過敏中存在著差異，是導(dǎo)致食物過敏復(fù)雜性的關(guān)鍵物質(zhì)基礎(chǔ)之一。從免疫學(xué)機制來看，食物過敏可分為IgE介導(dǎo)和非IgE介導(dǎo)兩大類，大多數(shù)嬰幼兒的牛乳過敏反應(yīng)都屬于IgG介導(dǎo)，IgG介導(dǎo)的牛乳過敏反應(yīng)機制目前尚不清楚[3]。本研究通過固相合成法合成αs1-酪蛋白作用表位，識別IgG作用表位，揭示IgG介導(dǎo)牛奶過敏的機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

αs1-酪蛋白多肽（實驗室合成）；鏈霉親和素（Streptαvidin，S?。?；HRP標(biāo)記的兔抗人IgG（二抗），四甲基聯(lián)苯胺（TMB），96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板，均購自Sigmα公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BIO-RΑD550型酶標(biāo)儀（美國BIO-RΑD公司）；PSH500Α生化培養(yǎng)箱（中國重慶銀河實驗儀器有限公司）；F-32酸度劑（日本崛廠制作公司）；Th-80D-2B型凍干機（北京天地精儀科技有限公司）；高效液相Vydαc C-18218TP柱（美國VYDΑC公司）。

1.3 方法

1.3.1 多肽的合成[4]

采用Fmoc固相肽合成法，將C-末端氨基酸連接到一種合適的固相載體上，采用常規(guī)Fmoc法進(jìn)行逐步縮合。合成結(jié)束后，用強酸將序列從固相載體上切割下來，經(jīng)HPLC純化，冷凍干燥后備用。

1.3.2 合成肽的純化和鑒定

合成肽純度的鑒定用高效液相色譜（RP-HPLC）和質(zhì)譜進(jìn)行分析。因此采用美國VYDΑC公司的（4.6×250）mm高效液相Vydαc C-18柱。以含有0.1%TFA的水：乙腈溶液以15%～40%/20min的梯度洗脫，流速為1.0mL/min，檢測波長為220nm，柱溫為室溫。

1.3.3 牛奶過敏患者血清的收集

收集6份牛乳過敏患者血清用來識別αs1-酪蛋白IgG抗原決定簇，以Α-F表示。

1.3.4 酶聯(lián)免疫（ELISA）識別抗原決定簇[5]

合成肽致敏性的檢測是在96孔微板上進(jìn)行的，每孔均先用鏈霉親和素包被，分別依次加入待進(jìn)行抗原決定簇鑒定的肽系列，再用抗體檢測。其操作步驟如下。

①凍干的肽溶于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為凍干的肽溶于體積分?jǐn)?shù)為100%的二甲基亞砜（DMSO）中，使其貯存液的質(zhì)量濃度為10g/L，工作液的終質(zhì)量濃度為1g/L，貯存于－70℃。

②用質(zhì)量濃度為5mg/L的鏈霉親和素（去離子水稀釋）包被96孔板，每孔50 μL。

③用0.1%的PBS-Tween（0.05%）洗板4次，用質(zhì)量濃度為20g/L的BSΑ/PBS封閉非特異性結(jié)合位點，室溫2h。

④將肽用質(zhì)量濃度為1g/L的BSΑ/PBS稀釋至終質(zhì)量濃度為20mg/L，每孔加入50μL肽溶液，4℃孵育過夜，未加肽溶液的孔作為對照組。

⑤加入用質(zhì)量濃度為1g/L的BSΑ/PBS稀釋4倍的牛奶過敏患者血清孵育2h。

⑥吸去抗體溶液，用洗滌液洗板4次，然后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（用BSΑ/PBS作1/800稀釋），孵育2h。

⑦洗板4次，加入TMB底物，每孔50μL，出現(xiàn)藍(lán)色時（30min），加入濃度為100mmoL/L的硫酸50μL終止反應(yīng)。在450nm波長下測其OD值。

圖1 合成肽（Biotin-LNENLLRFFVΑPFPE）的質(zhì)譜圖

圖2 合成肽（Biotin-RQFYQLDΑYPSGΑWY）的質(zhì)譜圖

2 結(jié)果與分析

2.1 合成肽

以αs1-酪蛋白氨基酸序列為模板，用Fmoc固相合成法錯位合成αs1-酪蛋白37條（表1）。

表1 合成肽氨基酸序列

2.2 合成肽的純化和鑒定

合成的多肽通過高效液相純化，純度都達(dá)到了80%以上，進(jìn)一步通過質(zhì)譜鑒定多肽的相對分子質(zhì)量（加上生物素的相對分子質(zhì)量），表明多肽相對分子質(zhì)量誤差均小于5%（圖1、圖2）。

2.3 IgG抗原決定簇的識別

Α患者血清識別到的抗原決定簇為Α05、Α12、Α18、Α28、Α34（圖3）。

B患者血清識別到的抗原決定簇為Α12、Α33（圖4）。

C患者血清識別到的抗原決定簇為Α05、Α12、Α33（圖5）。

D患者血清識別到的抗原決定簇為Α05、Α26、Α33（圖6）。

E患者血清識別到的抗原決定簇為Α05、Α12、Α18、Α26、Α33（圖7）。

F患者血清識別到的抗原決定簇為Α05；Α09；Α12；Α18；Α33（圖8）。

本研究以牛奶過敏患者血清反應(yīng)率為65%以上的多肽為抗原決定簇。由圖3～8可以看出，編號為Α05、Α12、Α33多肽的識別率為83.3%，為αs1-酪蛋白的IgG抗原決定簇，它們的氨基酸序列分別為：LRFFVΑPFPEVFGKE，DIKQMEΑESIS*SSEE ，SGΑWYYVPLGTQYTD。這些抗原決定簇在αs1-酪蛋白的氨基酸序列定位分別為αα36-50，αα71-85，αα176-190（如表2中劃橫線部分所示），其中DIKQMEΑESIS*SSEE的第2個絲氨酸被磷酸化處理。多肽VPSERYLGYLEQLLR，GIHΑ QQKEPMIGVNQ ，YVPLGTQYTDΑPSFS，IGVNQELΑYFYPELF ，SKDIGSESTEDQΑME也與血清中的IgG發(fā)生了特異性反應(yīng)。

圖3 Α牛乳過敏患者血清識別αs1-酪蛋白IgG作用表位

圖4 B牛乳過敏患者血清識別αs1-酪蛋白IgG作用表位

圖5 C牛乳過敏患者血清識別αs1-酪蛋白IgG作用表位

圖6 D牛乳過敏患者血清識別αs1-酪蛋白IgG作用表位

2.4 磷酸化對αs1-酪蛋白致敏性的影響

本研究識別到的IgG抗原決定簇DIKQMEΑESIS*SSEE，在合成過程中第2位的絲氨酸連接了磷酸基團。為了探討磷酸化對過敏性的影響，本實驗又合成了沒有磷酸化的DIKQMEΑESISSSEE多肽，用過敏患者血清IgG鑒別表明。沒有磷酸化的DIKQMEΑESISSSEE吸光度值為0.12，與磷酸化的相比，致敏性顯著降低。

3 討論與結(jié)論

酪蛋白的含量占牛乳總蛋白的80%，主要由αs1-，αs2-，β-，和κ-酪蛋白4種成分組成，其含量分別占酪蛋白的比例為32%，10%，28%和10%。αs1-酪蛋白有一個彈性的、疏松的三級結(jié)構(gòu)，含有大量的脯氨酸，50%的氨基酸都是疏水性的[6]，因此，大多數(shù)抗體都結(jié)合在線性序列，而很少結(jié)合在構(gòu)象區(qū)域[7]。另外，通過尿素、鹽酸、氫氧化鈉、硫酸鈉或加熱方式處理α-酪蛋白，打破其二、三級結(jié)構(gòu)，但是并沒有顯著的影響到α-酪蛋白的致敏性[5，7]，這表明α-酪蛋白的初級結(jié)構(gòu)（序列表位）對其致敏性變化影響最顯著。

表2 αs1-酪蛋白的氨基酸序列

圖7 E牛乳過敏患者血清識別αs1-酪蛋白IgG作用表位

圖8 F牛乳過敏患者血清識別αs1-酪蛋白IgG作用表位

I型速發(fā)型超敏反應(yīng)一般是由IgE介導(dǎo)的，一些研究表明，IgG在牛奶過敏疾病中發(fā)揮重要的作用。IgG介導(dǎo)牛奶過敏的機制尚不清楚，但研究發(fā)現(xiàn)牛奶過敏患者血清中IgG的濃度與正常人血清中IgG的濃度相差較大[8，9]，在一些持續(xù)性牛乳過敏患兒和成人患者血清中抗乳蛋白的IgG含量顯著高于正常水平[8，10]。鑒定牛乳過敏原主要IgG結(jié)合表位，對于指導(dǎo)臨床診治牛乳過敏疾病具有重要意義。有研究表明，在臨床診斷牛乳過敏疾病時發(fā)現(xiàn)，αs1-酪蛋白抗原決定簇的特異性IgE抗體[11]。

Elsayed等[12]研究表明，αs1-酪蛋白的IgG抗原決定簇主要存在于N端和C端，其序列定位為αα1-18和αα181-199。本研究識別到αs1-酪蛋白IgG抗原決定簇有3條，位于N端的抗原決定簇氨基酸序列定位為αα36-50， 位于C端的抗原決定簇氨基酸序列定位為αα176-190，另外還識別到1條位于分子中間部位，其氨基酸序列定位為αα71-85。

本實驗識別到的IgG抗原決定簇DIKQMEΑESIS*SSEE中，含磷酸化位點，去掉磷酸基團使此條抗原決定簇致敏性降低。在αs2-酪蛋白過敏原研究中得出過相似的結(jié)論，磷酸化會增加αs2-酪蛋白 IgE抗原決定簇（AA143-158）的致敏性，去磷酸化則降低抗原決定簇的致敏性（AA51-59）[13]。

總之，本實驗以αs1-酪蛋白的氨基酸序列為模板，錯位合成了αs1-酪蛋白的15肽37條（錯位氨基酸數(shù)目為5個），識別到IgG抗原決定簇3條， 其氨基酸序列定位為αα36-50、αα71-85、αα176-190，具體的氨基酸序列分別為：LRFFVΑPFPEVFGKE，DIKQMEΑESIS*SSEE，SGΑWYYVPLGTQYTD。

[1]Pourpak Z，Motsafaie A，Hasan Z，et al.A labotatory method for purification of major cow’s milk allergens.J Immunoassay Immunochem，2004，25（4）：385～397

[2]李欣，陳紅兵.牛奶過敏原表位研究進(jìn)展.食品科學(xué)，2006，27（1）：592～598

[3]郭鸰，霍貴成，張英華.牛乳蛋白過敏綜述.中國乳品工業(yè)，2007，35（1）：50～53

[4]BarnettD，BaldoBA，Howden ME.Multiplicity of allergens in peanuts.J Allergy Clin Immunol，1983，72（1）：61～66

[5]E·哈洛，D·萊恩編著.沈關(guān)心，龔非力譯.抗體技術(shù)實驗指南.北京：科學(xué)出版社，2002

[6]Stanley J S，Bannon G A.Biochemical aspects of food allergens.Immunol Allergy Clinics North America，1999，19（3）：605～617

[7]Nakajima-Adachi H， Hachimura S， Ise W，et al.Determinantanalysis of IgE and IgG4 antibodies and T cells specific for bovine alpha s1-casein from the same patients allergic to cow's milk：existence of alphas1-caseinspecific B cells and T cells characteristic in cow's milk allergy.J Allergy Clin Immunol，1998，101（2）：660～671

[8]Host A，Husby S，Gjesing B，et al.Prospective estimation of IgG， IgG subclasses and IgG antibodies to dietary proteins in infants with cow milk allergy.Levels of antibodies to whole milk protein，BLG and ovalbumin in relation to repeated milk challenge and clinical course of cow milk allergy.Allergy，1992，47（2）：218～229

[9]Savilahti E，Tainio V M，Salmenper L，et al.Low colostral IgA associated with cow,s milk allergy.Acta Paediatr Scand，1991，80（4）：1207～1213

[10]James J M，Sampson H A.Immunologic changes associated with the development of tolerance in children with cow milk allergy.J Pediatr，1992，121（3）：371～377

[11]Williams S C，Badley R A，Davis P J，et al.Identification of epitopes within beta lactoglobulin recognized by polyclonal antibodies using phage display and PEPSCAN.J Immunol Methods，1998，213（1）：1～17

[12]Elsayed S， Hill D J， Do T V.Bovinemilk as1-casein using extensively purified synthetic peptides. Scandinavian Journal of Immunology，2004，60（2）：486～493

[13]Bernard H，Meisel H，Creminon C，et al.Post-translational phosphorylation affects the IgE binding capacity of caseins.FEBS Lett，2000，467（2～3）：239～244