黃大海,孫福成

(衛(wèi)生部北京醫(yī)院心內(nèi)科,北京 100730)

血小板活化水平增高是許多疾病,包括心肌梗死、卒中和不穩(wěn)定型心絞痛的重要發(fā)病機(jī)制[1]。阿司匹林抗血小板聚集治療目前已經(jīng)成為冠心病和急性冠脈綜合征(ACS)患者一級(jí)預(yù)防及二級(jí)治療的基石[2]。小劑量阿司匹林在老年冠心病及 ACS患者中應(yīng)用較廣泛[3-4],但如何評(píng)價(jià)小劑量阿司匹林對(duì)于老年人血小板的聚集抑制效果,目前并不肯定。我們通過(guò)準(zhǔn)確測(cè)定血小板活化標(biāo)志物 GPⅡb/Ⅲa和CD62P水平,觀(guān)察小劑量阿司匹林對(duì)于老年冠心病人血小板膜表面糖蛋白表達(dá)率的影響,研究小劑量阿司匹林對(duì)老年冠心病人血小板活化功能的抑制程度,以期為臨床用藥提供參考。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象 根據(jù) 1979年世界衛(wèi)生組織(WHO)關(guān)于冠心病的診斷和分型標(biāo)準(zhǔn),選擇自2004年 9月至 2008年 5月間在北京醫(yī)院心內(nèi)科及老年病房住院和門(mén)診就診的老年冠心病患者共 116例。男性 90例,女性 26例,年齡 65～90歲,均符合下列條件之一:①陳舊性心肌梗死病史者;②冠狀動(dòng)脈造影(CAG)明確冠心病診斷者(冠狀動(dòng)脈主要血管直徑狹窄程度≥50%);③存在冠心病危險(xiǎn)因素,有典型心絞痛癥狀并伴有心電圖或心肌核素顯像提示心肌供血不足或有急性心肌梗死的動(dòng)態(tài)演變,伴有心肌酶譜的動(dòng)態(tài)改變。除外條件:急性腦血管疾病(1月以?xún)?nèi));深靜脈血栓形成;感染性疾病;合并服用其他抗血小板聚集的藥物(包括被證實(shí)含有抗血小板聚集作用的中藥)、抗凝藥品物或解熱鎮(zhèn)痛藥物;嚴(yán)重肝、腎功能受損,包括(ALT＞80 u/L,TBil＞2.0 g/L,DBil＞0.8 g/L,Cr＞2.0 g/L);消化道或其他臟器活動(dòng)性出血者;粒細(xì)胞或血小板減少者;惡性腫瘤患者。

116例老年患者按照阿司匹林(拜阿司匹林:德國(guó)拜耳制藥,100 mg/片)服用劑量不同分為:①阿司匹林 50 mg組(簡(jiǎn)稱(chēng) ASA50):單獨(dú)服用阿司匹林(ASA)50 mg/d,服藥 14 d以上。②阿司匹林100 mg組(簡(jiǎn)稱(chēng) ASA100):單獨(dú)服用 ASA100 mg/d,服藥 14 d以上。③對(duì)照組:2周內(nèi)未曾服用任何抗聚及抗凝藥物的冠心病患者。各組患者的基本資料如表 1。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本采集及處理 取血時(shí)間為每日上午 6～8點(diǎn)。取血前 8 h禁止吸煙,空腹12 h。采血前使患者保持安靜狀態(tài) 15 min。采用美國(guó) BD公司CTAD真空采血抗凝管取靜脈血 5 m l,抗凝劑與血液比例為 1∶9。血標(biāo)本室溫下保存,2 h之內(nèi)進(jìn)行樣本處理。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法 (1)血小板預(yù)活化:所有樣本用活化誘導(dǎo)劑:終濃度 10μmol/L ADP(二磷酸腺苷)和終濃度 500μmol/L AA(花生四烯酸)各30μl,與240μl樣本輕輕混勻,置 37℃環(huán)境放置5min,雙相激活血小板。(2)樣本制備及固定:分別取 PAC-1 FITC、CD62PPE、CD61 PerCP各 10μl加入一塑料試管中混勻作為測(cè)定管;另取 PAC-1 FITC、MIgGPE、CD61 PerCP、RGDS(5 mg/ml)各 10 μl加入一塑料試管中混勻作為對(duì)照管,兩管中分別加入經(jīng)過(guò)上述5m in激活靜脈抗凝血 5μl與試劑輕輕混勻、室溫條件下避光作用 20min,立即加入預(yù)冷 2～8℃的1%多聚甲醛 1 ml并混勻,置 2～8℃冰箱內(nèi) 2 h,24 h內(nèi)在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 全血流式細(xì)胞儀三色分析法測(cè)定血小板活化率 在 Cell Quest軟件環(huán)境中,按順序放置對(duì)照管和試驗(yàn)管,將流式細(xì)胞儀的前向角散射(FSC)、側(cè)向角散射(SSC)、三色熒光(FL1、FL3)的檢測(cè)信號(hào)均設(shè)置為對(duì)數(shù)放大,通過(guò)設(shè)定恰當(dāng)?shù)?FSC閾值排除細(xì)胞碎片和背景干擾。在檢測(cè) GPIIb/IIIa時(shí),以CD61 PerCP/SSC雙參數(shù)設(shè)門(mén),分別檢測(cè)對(duì)照管和測(cè)定管中單個(gè)血小板的光散射及三色熒光強(qiáng)度,并分析 FIBR(PAC-1)和 CD62P陽(yáng)性 CAP的百分率及平均熒光強(qiáng)度(MFI),以測(cè)定管與對(duì)照管 MFI的比值(RMFI)代表血小板表達(dá)活化分子標(biāo)志物的相對(duì)含量。

表1 受試者一般臨床資料的比較

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 測(cè)試完畢后用 Cell Quest軟件分析數(shù)據(jù),獲得待測(cè)標(biāo)本的血小板的熒光散點(diǎn)圖,對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果可表示為特異性熒光抗體結(jié)合的陽(yáng)性百分率和平均熒光強(qiáng)度(MFI)。計(jì)量資料用均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間資料分析采用單因素方差分析,組間均數(shù)間的比較采用最小顯著差異 t檢驗(yàn)(LSD-t檢驗(yàn)),計(jì)數(shù)資料采用百分?jǐn)?shù)表示,組間比較采用 χ2檢驗(yàn)。采用 SPSS統(tǒng)計(jì)軟件(10.0版本)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

2 結(jié)果

服用阿司匹林 50mg/d(ASA 50)組及 100mg/d(ASA 100組)2周以上的受試者與未服用阿司匹林的受試者(Control組)相比較,血小板膜表面糖蛋白PAC-1的陽(yáng)性表達(dá)率在 ASA50組、ASA100組和對(duì)照組分別為(64.40±15.71)%,(57.22±15.82)%及(75.8±15.71)%,兩種劑量阿司匹林均較對(duì)照組明顯降低(P＜0.05)。CD62P的陽(yáng)性表達(dá)率分別為(68.01±9.57)%,(60.44±9.30)%及(78.59±6.38)%,阿司匹林組均較對(duì)照組明顯降低(P＜0.05)。A50組與 A100組兩組間比較,PAC-1的陽(yáng)性表達(dá)率為 (64.40±15.71)%與(57.22±15.82)%,兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);CD62P的陽(yáng)性表達(dá)率為(68.01±9.57)%與(60.44±9.30)%,兩組間差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),見(jiàn)表 2。

表2 小劑量阿司匹林對(duì)血小板活化率的影響(±s,%)

表2 小劑量阿司匹林對(duì)血小板活化率的影響(±s,%)

注:與對(duì)照組比較,a P＜0.05,b P＜0.01

組別 例數(shù) PAC-1 CD62P對(duì)照組 45 75.8±15.71 78.59±6.38 ASA 50 35 64.40±15.71a 68.01±9.57a ASA 100 36 57.22±15.82b 60.44±9.30b

3 討論

關(guān)于阿司匹林抗血小板治療的最佳劑量,目前仍存在爭(zhēng)議。尤其在老年冠心病患者中,因?yàn)樗鸬南兰澳X等部位出血的并發(fā)癥發(fā)生率相對(duì)較高,阿司匹林在臨床使用中顧慮相對(duì)較多[5]。一些隨機(jī)試驗(yàn)結(jié)果表明,阿司匹林劑量在 50～1 500mg/d時(shí)都具有抗栓作用,即使每日服用 30mg仍能發(fā)揮確切的抗血小板作用[6]。在心血管疾病的預(yù)防治療中,阿司匹林宜選用最小的有效劑量[7]。多數(shù)專(zhuān)家推薦阿司匹林作為常規(guī)預(yù)防用藥的劑量在 75～150 mg/d,這是基于對(duì)眾多臨床試驗(yàn)匯總分析比較后的結(jié)果。同時(shí)阿司匹林的應(yīng)用有抵抗現(xiàn)象[8-10],即阿司匹林不能充分抑制 TXA2合成,生化表現(xiàn)為尿液中 TXA2的代謝產(chǎn)物 11脫氫 TXB2增高,這些患者心肌梗死、腦卒中或心血管死亡的聯(lián)合終點(diǎn)的危險(xiǎn)性增加(OR值 1.8)。這是因?yàn)榘⑺酒チ种饕绊懷“屦じ胶途奂闹虚g過(guò)程,抑制血小板聚集的程度不強(qiáng),且有較大的個(gè)體差異性。如何有效評(píng)價(jià)阿司匹林對(duì)于老年人血小板聚集的抑制程度,同時(shí)對(duì)臨床安全用藥提供幫助,避免相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生,是目前老年冠心病臨床治療中的難點(diǎn)之一[11-12]。

目前評(píng)價(jià)阿司匹林對(duì)血小板的抑制作用主要采用體外血小板最大聚集率抑制實(shí)驗(yàn)[13]。但此實(shí)驗(yàn)主要是對(duì)血小板被抑制后的功能評(píng)價(jià),是間接性的評(píng)價(jià),而且只能反映對(duì)某一種單一激活劑的阻斷作用,如花生四烯酸、ADP等。不能準(zhǔn)確反映血小板被抑制后,自身結(jié)構(gòu)所表現(xiàn)的與其功能相適應(yīng)的一系列結(jié)構(gòu)變化。在人體內(nèi),CAP的表達(dá)率很低,不能準(zhǔn)確反映阿司匹林對(duì)血小板聚集功能的整體抑制程度。而阿司匹林對(duì)血小板黏附和聚集功能的抑制是全身性、潛在性的,不能直接測(cè)定。FCM作為一種高效、快速、多參數(shù)分析的先進(jìn)技術(shù),可以非常靈敏地檢測(cè)到活化血小板膜表面糖蛋白分子的變化,并且可以準(zhǔn)確測(cè)定血小板膜糖蛋白的表達(dá)率,從而可以精確判斷血小板的功能狀態(tài)[14-15]。故可以通過(guò)體外特異性的多活化途徑激活血小板后,經(jīng) FCM儀測(cè)定活化后的血小板表面膜蛋白的表達(dá)率,直接顯示阿司匹林對(duì)血小板功能的抑制作用。

本項(xiàng)研究結(jié)果顯示:老年冠心病人連續(xù)服用阿司匹林 50～100mg/d兩周以上,與未服用阿司匹林組相比較,經(jīng)體外活化誘導(dǎo)劑雙相激活后,血小板膜表面糖蛋白的表達(dá)率明顯降低。表明經(jīng)兩種激活劑同時(shí)活化血小板,盡管活化強(qiáng)度很大,但是仍可以看到小劑量阿司匹林對(duì)于血小板活化功能的抑制作用。同時(shí)比較阿司匹林 50 mg/d與 100mg/d對(duì)血小板活化率的影響,阿司匹林 100 mg/d對(duì)血小板活化功能的抑制似更明顯,但兩組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本項(xiàng)研究結(jié)果表明:阿司匹林對(duì)老年人血小板黏附和聚集功能抑制程度的測(cè)定,可以經(jīng)體外雙相激活血小板后,運(yùn)用 FCM儀準(zhǔn)確測(cè)定血小板膜表面標(biāo)志性糖蛋白表達(dá)的陽(yáng)性率,從而判斷老年冠心病人血小板受抑制的程度,從而為臨床抗血小板聚集藥物的應(yīng)用提供參考。

[1] 陳紀(jì)林.冠心病抗血小板治療的進(jìn)展[J].中國(guó)循環(huán)雜志,2004,19(1):5-6.

[2] Antithrombotic Trialists′Collaboration.Collaborative meta-analysis of randomised trials of antip latelet therapy for prevention of death,myocardial infarction,and stroke in high risk patients[J].BMJ,2002,324(7329):71-86.

[3] 楊維維,唐海沁.阿司匹林在心血管疾病中的應(yīng)用進(jìn)展[J].中國(guó)臨床保健雜志,2007,10(5):535-538.

[4] 孫武,岳永煥,孫彩艷.心內(nèi)科門(mén)診使用阿司匹林情況的調(diào)查[J].中國(guó)基層醫(yī)藥,2007,14(6):1022.

[5] 芮銘安,柏金喜,張哲永,等.小劑量阿司匹林腸溶片致上消化道出血危險(xiǎn)因素分析[J].中國(guó)臨床保健雜志,2008,11(3):255-257.

[6] The SALT Collaborate Group.Swedish Aspirin Low-dose Trial(SALT)of 75mg Aspirin as secondary prophylaxis after cerebrovascu lar ischemic events[J].Lancet,1991,338(8779):1345-1491.

[7] Patrono C,Coller B,FitzGerald GA,et al.Plaelet-active Drugs:The relationships Among Dose,Effectiveness,and Side Effect.The Seventh ACCPConference on Antithrombotic and Thrombolytic Therapy[J].Chest,2004,126supp l3:234-264.

[8] 韋建瑞,吳櫻櫻,張文超,等.流式細(xì)胞術(shù)預(yù)測(cè)冠心病患者阿司匹林抵抗的研究[J].中國(guó)基層醫(yī)藥,2008,15(8):1233-1234.

[9] Krasopoulos G,Brister SJ,Beattie WS,et al.Aspirin“resistance”and risk of cardiovascularmorbidity:systematic review andmeta-analysis[J].BMJ,2008,336(7637):195-198.

[10] 劉宏宇.阿司匹林抵抗[J].中國(guó)基層醫(yī)藥,2008,15(4):689.

[11] 楊維維,唐海沁,徐維平,等.阿司匹林不同劑量和給藥方法的藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)研究[J].中國(guó)臨床保健雜志,2007,10(6):607-610.

[12] 郝衛(wèi)軍,司全金,李小鷹.老年心血管疾病患者應(yīng)用不同劑量阿司匹林抗血小板治療的臨床研究[J].中國(guó)臨床保健雜志,2006,9(3):210-211.

[13] Michelson AD,Frelinger AL III,Furman MI.Current options in platelet function testing[J].Am J Cardiol,2006,98(10A):4-10.

[14] Michelson AD.Flow cytometry assessment of glycoprotein movements in Platelets[J].Platelets,1997,8(2):105-115.

[15] Abrams C,Shattil SJ.Immunological detection of activation platelets in clinical disorder[J].Thromb Haemost,1991,65(5):467-650.