赫 琰,吳 強(qiáng),程鐵峰

(1.河南大學(xué)藥學(xué)院藥劑教研室,河南 開封 475004;2.開封市第六人民醫(yī)院藥械科,河南 開封 475001)

K6SiNiW11O39對堿性成纖維細(xì)胞生長因子誘導(dǎo)的血管生成的影響

赫 琰1,2,吳 強(qiáng)1*,程鐵峰1

(1.河南大學(xué)藥學(xué)院藥劑教研室,河南 開封 475004;2.開封市第六人民醫(yī)院藥械科,河南 開封 475001)

目的:研究K6SiNiW11O39(SiWNi)對堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)誘導(dǎo)的血管生成的影響。方法:應(yīng)用血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、浸潤、遷移、管形成以及雞胚尿囊膜血管形成等體內(nèi)外生物學(xué)實(shí)驗(yàn)觀察SiWNi對bFGF誘導(dǎo)的血管生成的影響。結(jié)果:SiWNi能夠劑量相關(guān)性的抑制bFGF誘導(dǎo)的ECV-304細(xì)胞增殖;在SiWNi與bFGF(100 μ g/L)摩爾比為1∶1的觀察點(diǎn),SiWNi能夠明顯抑制 bFGF誘導(dǎo)的 ECV-304細(xì)胞的浸潤、遷移、管形成以及雞胚尿囊膜血管形成。結(jié)論:SiWNi對bFGF誘導(dǎo)的血管生成有明顯抑制作用。

血管生成;K6SiNiW11O39;堿性成纖維細(xì)胞生長因子;細(xì)胞增殖;浸潤和遷移

血管生成(angiogenesis)是指原有血管在一些血管生成因子的作用下,通過業(yè)已存在的血管的基底膜及周圍基質(zhì)的溶解,血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、浸潤和重排,形成新的血管并與原來血管系統(tǒng)吻和的過程。近年來,大量研究結(jié)果表明血管生成能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展和遷移[1]。因此,抗血管生成治療成為癌癥生物治療中的一種理想策略。目前,已有許多腫瘤誘導(dǎo)的促血管生成因子被鑒定出來,如血管內(nèi)皮生長因子和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)[1-2],它們對血管生成產(chǎn)生的各個步驟具有廣泛的影響,已成為重要的抗癌靶點(diǎn),阻斷其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑已經(jīng)成為抗癌藥物研究的一個重要方向。文獻(xiàn)[3]報道,聚金屬氧酸鹽類化合物具有廣泛的抗病毒及抗癌活性。本實(shí)驗(yàn)以K6SiNiW11-O39(SiWNi)為代表性化合物,觀察這類化合物對bFGF誘導(dǎo)的血管生成作用的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(ECV-304)購自武漢細(xì)胞所(TACC);Clean級受精種雞蛋購自長春市養(yǎng)雞場;K6SiNiW11O39由本實(shí)驗(yàn)室合成;bFGF由暨南大學(xué)生物工程研究所惠贈;MT T、小牛血清及RPMI-1640培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品;基質(zhì)膠(matrigel)、Collagen type I和8 μ m微孔的24孔細(xì)胞培養(yǎng)碟購自BD公司(Bedford Massachusetts);其余試劑均為市售分析純級產(chǎn)品;GENIOSA-5082酶標(biāo)儀為T ECAN公司產(chǎn)品;倒置顯微鏡為Olympus公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 MT T法測定SiWNi對于bFGF誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖作用的影響 ECV-304細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2及飽和濕度的條件下培養(yǎng),將對數(shù)生長期的細(xì)胞以1×103/孔的密度接種于96孔板,各孔加入10 ng bFGF以及不同濃度的SiWNi。孵育72 h后,加入MT T溶液(20 μ L/孔),37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2條件下培養(yǎng)5 h,然后加入DMSO中止反應(yīng),在酶標(biāo)儀上測定各孔溶液在570nm處的吸光度值。

1.2.2 SiWNi對于bFGF體外誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞浸潤和遷移作用的影響 ①倒置細(xì)胞培養(yǎng)碟,在其外底側(cè)均勻涂布 10 μ L Collagen type I,在正壓凈化工作臺內(nèi)風(fēng)機(jī)中速運(yùn)轉(zhuǎn)的情況下,風(fēng)干30min;將細(xì)胞培養(yǎng)碟正放在24孔培養(yǎng)板的空孔內(nèi),在其底側(cè)均勻涂布10 μ L matrigel膠,風(fēng)干 30min。 ②胰酶分散ECV-304細(xì)胞并用完全培養(yǎng)基制成1×105/mL的細(xì)胞懸液。③24孔培養(yǎng)板每孔中加入600 μ L完全培養(yǎng)基,并添加相應(yīng)空白對照組(PBS)、陽性對照組(bFGF 100 ng/孔)和樣品組(SiWNi∶bFGF=1∶1,molar ratio),正向放置步驟:①處理好的細(xì)胞培養(yǎng)碟在培養(yǎng)碟內(nèi)添加步驟。②制備的細(xì)胞懸液100 μ L,搖勻細(xì)胞,在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2條件下培養(yǎng)16 h。④從細(xì)胞培養(yǎng)板中取出細(xì)胞培養(yǎng)碟,用耳科醫(yī)用棉棒拭去培養(yǎng)碟內(nèi)未浸潤細(xì)胞,甲醇固定浸潤細(xì)胞培養(yǎng)碟底膜并貼壁的細(xì)胞,Giemsa(曙紅/蘇木精)染色,在×200放大倍數(shù)條件下照相,并進(jìn)行細(xì)胞計數(shù),比較不同處理組之間浸潤細(xì)胞數(shù)。

1.2.3 SiWNi對于bFGF體外誘導(dǎo)血管形成的影響 ①24孔培養(yǎng)板每孔中加入600 μ L matrigel膠,在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2條件下孵育30min使膠凝固。②胰酶分散ECV-304細(xì)胞并用完全培養(yǎng)基制成1×105/mL的細(xì)胞懸液,添加相應(yīng)空白對照組(PBS)、陽性對照組(bFGF 100ng/well)和樣品組(SiWNi∶bFGF=1∶1,molar ratio)。③在步驟①處理好的孔中加入步驟②制備的細(xì)胞懸液200 μ L,搖勻后放回37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。在×200放大倍數(shù)條件下照相,觀察不同處理組之間內(nèi)皮細(xì)胞管狀排列情況、單位面積內(nèi)管狀結(jié)構(gòu)數(shù)量以及完整程度的差異,得出定性和半定量分析結(jié)果。

1.2.4 SiWNi對于bFGF體內(nèi)誘導(dǎo)雞胚尿囊膜血管形成的影響 ①準(zhǔn)備5 d齡雞胚,從氣室處開一小孔,用無菌注射器從每個雞胚抽出約2mL蛋清,以使雞胚絨毛尿囊膜和殼膜較好分離。②24 h內(nèi)在氣室處開窗,輕輕用消毒鑷子剝?nèi)つ?暴露雞胚絨毛尿囊膜。③取1 cm×1 cm無菌濾紙條,上面滴加10 μ L不同溶液,分別為空白對照組(PBS)、陽性對照組(bFGF 100 ng/egg)和樣品組(SiWNi∶bFGF=1∶1,molar ratio),將以上濾紙條放置在尿囊膜上,然后用封口膜封口。每個處理設(shè)10個雞胚的重復(fù)。④72 h后,觀察覆蓋處及周圍雞胚絨毛尿囊膜血管生成情況。最后用Nikon4500照相機(jī)在照蛋器上拍攝雞胚尿囊膜血管形成狀況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用q檢驗(yàn),P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 SiWNi對bFGF誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用的影響

圖1 SiWNi對bFGF誘導(dǎo)的 ECV-304細(xì)胞增殖作用的影響

由圖1可知,初始單獨(dú)加bFGF的ECV-304細(xì)胞懸液的光密度值為1.125±0.25,在SiWNi與bF-GF的摩爾比為0.2～1∶1的低濃度范圍內(nèi),隨著Si-WNi濃度的提高,細(xì)胞懸液的光密度值逐漸降低,表明SiWNi能夠劑量相關(guān)性抑制bFGF誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖。

2.2 SiWNi對bFGF體外誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞浸潤和遷移作用的影響

圖2 SiWNi對bFGF體作用的影響(×200)

由圖2可知,bFGF(100 μ g/L)陽性組細(xì)胞遷移數(shù)明顯多于空白對照組以及SiWNi與bFGF的摩爾比為1的樣品組。統(tǒng)計結(jié)果表明,空白對照組、陽性組和樣品組的細(xì)胞遷移數(shù)分別為65±11、240±35和25±7。分析細(xì)胞遷移數(shù)結(jié)果可知,bFGF能夠明顯促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移,而SiWNi的加入,導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞遷移數(shù)明顯降低,表明SiWNi能夠明顯抑制bFGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞浸潤,遷移。

2.3 SiWNi對體外bFGF誘導(dǎo)血管形成的影響

圖3 SiWNi對體外bFGF誘導(dǎo)的ECV-304細(xì)胞管形成的影響(×200)

由圖3可知,bFGF(100 μ g/L)陽性組內(nèi)皮細(xì)胞所形成管狀結(jié)構(gòu)密度明顯大于空白對照組以及SiWNi與bFGF的摩爾比為1的樣品組?？瞻讓φ战M的內(nèi)皮細(xì)胞所形成的管狀結(jié)構(gòu)管腔大,管狀結(jié)構(gòu)密度低。樣品組的內(nèi)皮細(xì)胞所形成的管狀結(jié)構(gòu)與空白對照組的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)類似,但是在觀察的視野內(nèi)管狀結(jié)構(gòu)密度更低,管狀結(jié)構(gòu)出現(xiàn)大量間斷,表明未形成完整管狀結(jié)構(gòu)。統(tǒng)計結(jié)果表明,空白對照組、陽性組和樣品組的內(nèi)皮細(xì)胞所形成管狀結(jié)構(gòu)的周長分別為(10225 ±1100)μ m 、(26968±1681)μ m 和(6649±924)μ m。陽性組管狀結(jié)構(gòu)的周長明顯大于空白對照組和樣品組,表明bFGF能夠明顯促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的管形成,而SiWNi的加入,導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞管形成的數(shù)量和密度明顯降低,表明SiWNi能夠明顯抑制bFGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞管形成。

2.4 SiWNi對體內(nèi)bFGF誘導(dǎo)雞胚尿囊膜血管形成的影響

由圖4可知,空白對照組和bFGF陽性組(100 ng/egg)的雞胚尿囊膜血管呈葉脈狀分布,清晰可見,血管分支適中,但bFGF陽性組雞胚尿囊膜主血管和毛細(xì)血管數(shù)明顯多于空白對照組,并且bFGF陽性組雞胚尿囊膜主血管管徑比空白對照組粗,表明接種bFGF明顯刺激了雞胚尿囊膜的血管生成。與這2組結(jié)果相比,SiWNi與bFGF的摩爾比為1的樣品組的雞胚尿囊膜主血管和毛細(xì)血管數(shù)明顯少于bFGF陽性組,表明SiWNi明顯抑制了bFGF誘導(dǎo)的雞胚尿囊膜血管生成。

3 討論

bFGF是一類與腫瘤血管生成相關(guān)的重要調(diào)控因子。bFGF能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移;如果將內(nèi)皮細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境下培養(yǎng),即用基質(zhì)膠模擬的基底膜上培養(yǎng),bFGF能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞形成管狀結(jié)構(gòu);此外,bFGF能夠促進(jìn)雞胚尿囊膜血管形成,這些實(shí)驗(yàn)已普遍用于體外、體內(nèi)的血管生成模擬[4]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用這些手段觀察了聚金屬氧酸鹽類化合物Si-WNi對bFGF誘導(dǎo)的血管生成的影響。在體內(nèi)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中:SiWNi能夠劑量相關(guān)性的抑制bFGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞 ECV-304增殖;在SiWNi與 bFGF(100 μ g/L)摩爾比為1∶1的觀察點(diǎn),SiWNi能夠明顯抑制bFGF誘導(dǎo)的ECV-304細(xì)胞的浸潤和遷移、管形成。體外進(jìn)行的雞胚尿囊膜血管形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)果。因此,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,SiWNi具有明顯的抗bFGF誘導(dǎo)的血管生成作用。

SiWNi是無機(jī)剛性多陰離子,其結(jié)構(gòu)明顯與已知的有機(jī)多陰離子bFGF抑制劑如肝素類衍生物不同。這些化合物與bFGF的作用機(jī)理主要是與bFGF通過靜電作用、疏水作用等非共價鍵進(jìn)行結(jié)合,阻斷bFGF與其細(xì)胞表面受體結(jié)合,切斷bFGF轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑,從而影響其生物活性的發(fā)揮[5]。在本項(xiàng)研究中,我們僅考察了聚金屬氧酸鹽類化合物SiWNi對bFGF生物活性的影響。研究表明,SiWNi具有明顯的抗bFGF誘導(dǎo)的血管生成作用。但是,這類化合物與bFGF作用的詳盡機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。

[1]Holash J,Maisonpierre PC,Compton D,et al.Vessel cooption,regression,and growth in tumors mediatedby angiopoietins and VEGF[J].Science,1999,284(5422):1994-1998.

[2]Schmidt NO,Westphal M,Hagel C,et al.Levels of vascular endothelial growth factor,hepatocyte factor/scatter factor and basic fibroblast growth factor in human gliomas and their relation to angiogenesis[J].Int J Cancer,1999,84(1):10-18.

[3]Rhule JT,Hill CL,Judd DA,et al.Polyoxometalates in Medicine[J].Chem Rev,1998,98(1):327-357.

[4]李錦軍,葛超,朱洪新,等.高通量腫瘤血管新生研究平臺的建立[J].腫瘤,2001,21(6):435-440.

[5]Liekens S,Leali D,Neyts J,et al.Modulation of fibroblast growth factor-2 receptor binding,signaling,and mitogenic activity by heparin-mimicking polysulfonated compounds[J].M ol Pharmacol,1999,56(1):204-213.

[責(zé)任編輯 姬 荷]

Effects of K6SiNiW11O39on thebasic fibroblast growth factor induced angiogenesis

HE Yan1,2,WU Qiang1*,CHENG Tie-feng1(1.Medicament Department of Pharmaceutical College,Henan University,Kaifeng,Henan 475004,China;2.Medicine Subject Dept.of Kaifeng Sixth People＇s Hospital,K ai feng,Henan 475001,China.)

Objective:To study the effects of K6SiNiW11O39(SiWNi)on the basic fibroblast growth factor(bFGF)induced angiogenesis.Methods:The effects of SiWNi on the bFGF-induced angiogenesis were observed by biological assays in vitro/vivo,including proliferation,migration,invasion and tube formation of human umbilical vein endothelial cells,as well as tube formation of chicken chorioallantoic memberane.Results:SiWNi could inhibit bFGF-induced proliferation of ECV-304 cells in a dose-dependent manner;At 1∶1molar ratio of SiWNi and bFGF(100 ng/mL),SiWNi could inhibit bFGF-induced invasion,migration and tube formation of of ECV-304 cells in vitro and tube formation of chicken chorioallantoic memberane in vivo significantly.Conclusion:SiWNi could inhibit bFGF-induced angiogenesis significantly.

Angiogenesis;K6SiNiW11O39;Basic fibroblast growth factor;Cell proliferation;Invasion and migration

R966

A

1672-7606(2010)02-0116-04

2010-02-15

河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目(424420041)

赫琰(1969-),男,河南通許人,碩士研究生,從事抗癌藥物作用機(jī)理方面的研究工作。

*通訊作者:吳強(qiáng)(1970-),男,河南 開封 人,博士,講師,從事藥物與生物大分子相互作用教學(xué)及研究工作。