于學軍綜述,何作云審校

(第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院全軍心血管病研究所,重慶400037)

血管內皮細胞和平滑肌細胞間的相互調節(jié)是血管生理和病理學研究的重要內容之一。近年研究發(fā)現,縫隙連接在血管內皮細胞與平滑肌細胞間相互調節(jié)過程中起著重要作用。本文僅對縫隙連接在血管內皮和平滑肌細胞之間信號傳遞的研究進展作一綜述。

1 縫隙連接和縫隙連接蛋白縫隙連接蛋白(connexin,Cx)

1.1 縫隙連接 在介導細胞接觸的蛋白復合物如Cx、橋粒及細胞黏附分子中,縫隙連接允許相鄰細胞間的直接通訊[1-2]。多種分子量不大于1.0 kd物質能以被動擴散的方式經過縫隙連接管道進行交換,如代謝產物、離子、第二信使、水及電沖動[3]。在某些條件下,半通道也能發(fā)揮作用,允許細胞釋放和攝取可擴散分子[4]。血管內皮細胞與平滑肌細胞間的縫隙連接可以穿過內彈力層,使血管內皮細胞和平滑肌細胞進行直接的電和化學交流[5]。

1.2 Cx Cx亞單位是一種4次橫跨細胞膜的跨膜蛋白,包括2個細胞外環(huán)和1個細胞內環(huán),其C末端和N末端均位于胞漿內。在兩個細胞外環(huán)中,3個半胱氨酸殘基的順序是高度保守的(Cx31除外),其基本結構是:第一個環(huán)(CX6 CX3C);第二個環(huán)(CX5 X5C)。而胞漿內的羧基末端區(qū)域具有明顯的差異,它可以因為胞內信號變化而改變蛋白構象,從而對縫隙連接功能狀態(tài)有影響[2]。2個環(huán)上相應的半胱氨酸可能形成二硫橋以在2個連接子鉚合期間使環(huán)穩(wěn)定[3]。在哺乳動物細胞類型中,發(fā)現其表達的Cx已達21種[1]。血管內皮細胞可以同時表達Cx37、Cx40和 Cx43,其中 Cx37表達量最高[6]。完整的內皮細胞是維持血管正常生理功能所必需的,而Cx43是維持內皮連續(xù)性及完整性所必需的,在大動脈和血流穩(wěn)態(tài)被擾亂的區(qū)域Cx43的表達較高。血管平滑肌細胞可以協同表達Cx43、Cx40、Cx45和 Cx37,其中 Cx43表達量最高,其他 3種連接蛋白的表達量依次遞減。不同類型的連接蛋白可以形成不同類型的連接子,不同類型的連接子可以形成不同類型的縫隙連接通道,而不同類型的縫隙連接在電導率、通透性及門控通道等特性方面均有很大的差別,這樣就構成了縫隙連接在結構組成和功能方面的多樣性[6]。同一種細胞或組織上表達多種不同類型的連接蛋白有著重要的生理意義。當機體受到高血壓、動脈硬化、缺血缺氧等所致細胞損傷或增生后,通過改變連接蛋白的表達比例,可以明顯改變細胞之間的通訊,進而調節(jié)其功能。不同的Cx同型異構體的組合有助于異型細胞間縫隙連接通道的形成,而這種組成可導致調節(jié)的多樣性。也有研究顯示,不同Cx形成縫隙連接具有不同的通透性,可選擇性通過不同的第二信使如環(huán)磷酸腺苷(cAM P)、環(huán)磷酸鳥苷(cGM P)、Ca2+或三磷酸肌醇(IP3),從而影響不同的生物學功能[7]。

2 縫隙連接功能的調節(jié)

縫隙連接通道的通透性受多種因素的影響,諸如pH值、Ca2+濃度、電壓、環(huán)核苷酸、轉化的病毒癌基因的活性等,但它們的作用多數是通過改變連接蛋白的磷酸化狀態(tài)發(fā)揮的,磷酸化狀態(tài)幾乎影響了連接蛋白從合成、組裝、功能發(fā)揮到降解的整個生命周期。

2.1 Cx的代謝 縫隙連接的形成和降解是一個動態(tài)的過程,大多數縫隙連接的生命周期(lifecycle)很短(普遍短于 5 h),小鼠肝細胞縫隙連接在體內的生命周期約5 h,大鼠心肌細胞的縫隙連接生命周期約1.3 h[8]。連接蛋白首先在內質網內合成,然后以出芽的方式與高爾基腔室的cis-或trans-高爾基網絡融合,在此過程中6個連接蛋白寡聚化,形成六聚體的連接子,此時合成的寡聚化的連接子尚處于關閉狀態(tài),一系列運輸囊泡將連接子運送至細胞膜,連接子可以融合入細胞膜上原有的縫隙連接斑,也可與鄰近細胞的連接子形成新的縫隙連接,多個新的縫隙連接再形成新的縫隙連接斑,此時的連接子才具有了開放的潛能,在適宜的刺激下,可以介導電和化學信號的傳導[9]?？p隙連接斑的降解一般是從內部結構開始,內部結構變疏松后可以融入細胞內形成環(huán)狀連接(annular junctions),此過程被稱為連接蛋白的內化(internalization),環(huán)狀連接最終在細胞內被溶酶體或蛋白酶降解(degradation),多余的或有缺陷的連接蛋白也是由蛋白酶或溶酶體消化降解[9]。

目前研究發(fā)現,許多生長因子如內皮素、血管緊張素Ⅱ、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、堿性成纖維細胞生長因子(b-FGF)及血管內皮生長因子(VEGF)等可通過不同的信號通路來影響Cx的表達[2,4]。近來發(fā)現,機械性刺激如切應力也可影響Cx的表達[10]。

2.2 連接蛋白磷酸化對縫隙連接功能的影響 許多蛋白激酶可以引起連接蛋白的磷酸化,并調節(jié)縫隙連接的功能。以Cx43為例,其羧基末端的2個酪氨酸和21個絲氨酸中的12個可以被不同的激酶磷酸化。酪氨酸激酶v-Src可以磷酸化Cx43 C末端第247和265位的酪氨酸,表皮生長因子、VEGF和血小板衍生生長因子等刺激因素通過受體介導的途徑可以激活絲裂原活化蛋白激酶(m itogen activated p rotein kinase,MAPK)、蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)和 c-Src等激酶,這些激活的激酶可以磷酸化Cx43不同位點的絲氨酸或酪氨酸,其中MAPK可以磷酸化255,279和282位的絲氨酸,PKC可以磷酸化368和372位的絲氨酸[3],二者均可以引起縫隙連接通道的關閉,抑制縫隙連接的功能。PKC的磷酸化作用還可以引起Cx43構象發(fā)生變化,從而降低通道的通透性[7];抑制寡聚化的連接蛋白向細胞膜的運輸以及縫隙連接全通道的形成,從而抑制縫隙連接的功能[2]。有資料表明,在Cx43寡聚化和向細胞膜運輸過程中,M APK和PKC介導的連接蛋白磷酸化保證了Cx43半通道呈關閉狀態(tài),從而避免了細胞膜的滲漏,保持了細胞內環(huán)境的穩(wěn)定[7]。多種刺激可以引起細胞內cAMP的增加,后者可以加強Cx43的磷酸化和增加細胞間的縫隙連接交流,此過程由蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)介導,PKA可以磷酸化 Cx43的C2末端第364,365,369和373位絲氨酸,從而增加Cx43的合成、增加連接子向細胞膜的運輸,導致縫隙連接形成增加,原有縫隙連接通道大小和數量增加。P34cdc2可以磷酸化262位的絲氨酸,酪氨酸激酶1(casein kinase 1,CK 1)可以磷酸化325,328和330位的絲氨酸,PKA和CK 1還可以上調連接蛋白的合成和組裝,加強縫隙連接的功能[3]。既然Cx43擁有眾多的磷酸化位點,理論上推測,磷酸酶(phosphop rotein phosphatases,PP)必然對其有作用。事實上:磷酸酶 PP1和 PP2B的抑制劑——okadaic acid,可以延遲Cx43的去磷酸化、延遲細胞間交流的恢復時間。但是,在許多細胞實驗中發(fā)現,okadaic acid對Cx43在SDSPAGE膠上的遷移和縫隙連接交流無明顯作用。由此可以推測,磷酸酶在調節(jié)縫隙連接交流中具有多種作用,但對它的充分理解有賴于對連接蛋白磷酸化位點的研究,以及對連接蛋白磷酸化作用的充分認識。

2.3 縫隙連接通道的門控調節(jié) 縫隙連接通道是電壓依從性的,其依從性的程度隨Cx類型而變化,異型縫隙連接通道的電壓依從性由組成通道的Cx類型決定。通道的傳導性由兩個耦聯的細胞間的電勢差即傳導連接電壓(transjunctional potential,V j)來調節(jié),也可由細胞內外的電勢差來調控。電壓依從性在非興奮組織中的作用不甚明確,可能是將受損細胞與周圍正常細胞分開。因為縫隙連接通道有同型和異型之分,所以它們的電壓依從性各不相同,由Cx32或Cx26組成的同型縫隙連接通道的電壓依從性很相似,當V j小于50 m V時,其電壓敏感性極不穩(wěn)定,且無瞬時電壓依從性,Cx32/x26異型縫隙連接通道則表現出不對稱的瞬時電壓依從性,當Cx32占優(yōu)勢時,電壓依從性的穩(wěn)定性消失[11]。Cx的電壓依從性通常由Boltzmann數來定量。研究證實許多電壓依從性通道都有一個決定電壓敏感性的結構域,稱為S4區(qū),它是一個獨特的氨基酸殘基的延伸,跨越質膜,且每隔三個位點就有一個正電荷殘基。Cx縫隙連接通道無S4區(qū),Cx的第一個細胞外環(huán)(E1)和第二個跨膜區(qū)(M 2)是其電壓依從性決定因素,El感受電壓變化,而M 2中的脯氨酸殘基則是電壓感受器和電壓門控的轉換因子[12]。電壓觸發(fā)的縫隙連接的啟閉與pH誘導的啟閉既獨立又交叉[13]。與其他電壓敏感的離子通道相比,縫隙連接不具有S4樣結構的電壓感受器。在大多數的細胞中,連接蛋白是電壓敏感的,Rubin等[14]在xenopus卵母細胞間Cx26與Cx32組成的異型縫隙連接間發(fā)現了一種在同型縫隙連接中不存在的新的電壓依賴性,這種電壓依賴性對于膜電位非常敏感,由此得出縫隙連接的電壓敏感性不僅取決于單個連接蛋白內在特性,而且也依賴于連接蛋白間相互作用的一些特性。用Cx32El區(qū)的E24 l和S242的氨基酸殘基替代 Cx26E1區(qū)的帶二價正電子的K 241和E242的氨基酸殘基,縫隙連接則失去電壓依賴特性,說明E1區(qū)域是縫隙連接對電壓快或慢反應機制的關鍵區(qū)域。有人利用Cx43/Cx32嵌合體發(fā)現,羧基末端與M 2間的區(qū)域與電壓依賴的通道啟閉相關,Cx26分子中第87位脯氨酸殘基的突變將逆轉通道的電特性[15]?？傊?連接蛋白在胞內的不同部分的相互作用構成一個“電荷復合體”,是電壓感受器的一個集合部分。同一種或不同Cx的相互作用改變了閥門的極性,從而影響了縫隙連接的啟閉。

3 縫隙連接介導的信號在血管內皮細胞和平滑肌細胞間的傳遞

傳統的觀點認為縫隙連接只能在同型細胞間建立,現在研究表明,不同類型的細胞間也可以建立縫隙連接。對大鼠小動脈和微動脈的研究發(fā)現,在其血管內皮細胞和平滑肌細胞內存在Cx的表達,Cx43和Cx37分別存在血管內皮細胞和平滑肌細胞內,而Cx40蛋白僅僅存在平滑肌細胞中,Cx43是內皮和平滑肌細胞縫隙連接的主要蛋白[16]。內皮和平滑肌細胞間的這種縫隙連接稱為肌內皮連接,而這種異型細胞間的通訊在調節(jié)血管收縮和舒張功能中起到重要的作用?？p隙連接傳遞的信號介質仍不十分清楚。目前認為主要有以下幾種:

3.1 電耦聯 內皮源性超極化因子(EDH F)是近年來研究較多的內皮源性舒張因子,EDH F不是單一的1種化學物質,而是在內皮細胞中生成的多種因子,包括Ca2+的動態(tài)平衡,K+通道的激活等,它先引起血管內皮細胞的超極化,并通過血管內皮細胞-平滑肌細胞縫隙連接的電耦聯作用,將超極化電流傳遞至平滑肌細胞,引起平滑肌細胞的超極化,促發(fā)平滑肌的舒張。乙酰膽堿(Ach)引起的內源性平滑肌舒張被認為是EDH F參與導致的。Liaor等[17]通過研究新西蘭大耳兔的腸系膜小動脈,發(fā)現在腸系膜動脈內皮和平滑肌細胞間存在縫隙連接,內皮細胞通過縫隙連接通訊把超級化信號傳到平滑肌細胞引起腸系膜動脈的舒張,而縫隙連接阻滯劑可以抑制由A ch的血管舒張作用。但是也有少部分研究表明縫隙連接在血管收縮反應中也起重要的作用。洪濤等[18]的研究發(fā)現用縫隙連接阻滯劑Heptano l可以抑制兔蛛網膜下腔出血后急性和慢性腦血管痙攣。腦池內注射Heptanol能有效抑制由蛛網膜下腔出血引起的形成腦血管收縮。但其機制尚不清楚。

3.2 鈣離子 最近,Isakson等[19]應用血管內皮和平滑肌細胞聯合培養(yǎng)模型發(fā)現:(1)用預先耗竭平滑肌細胞內質網的Ca2+后,應用 ATP刺激血管內皮細胞,平滑肌細胞內的[Ca2+]i仍有明顯升高;而預先耗竭血管內皮細胞內質網的Ca2+,后應用苯腎上腺素刺激平滑肌細胞,血管內皮細胞內的[Ca2+]i也有明顯升高。(2)預先在血管內皮細胞內加入Ca2+螯合劑,應用ATP刺激血管內皮細胞,血管內皮和平滑肌細胞均沒有[Ca2+]i的升高;應用苯腎上腺素刺激平滑肌細胞,則僅有平滑肌細胞本身[Ca2+]i的升高,血管內皮細胞內的[Ca2+]i無明顯變化。(3)預先在平滑肌細胞內加入Ca2+螯合劑,應用ATP刺激血管內皮細胞,血管內皮本身[Ca2+]i升高,平滑肌細胞內[Ca2+]i無明顯變化;但在應用苯腎上腺素刺激平滑肌細胞時,盡管平滑肌細胞本身[Ca2+]i無明顯變化,血管內皮細胞內的[Ca2+]i卻有明顯升高。這些結果提示Ca2+在縫隙連接介導的信號傳遞中充當著重要的信使,它通過縫隙連接進行跨膜運動而發(fā)揮其生物學作用。

3.3 IP3以前的研究顯示,來源于血管平滑肌細胞的IP3能夠調節(jié)內皮細胞的Ca2+儲備,但反之則不然,這提示IP3通過縫隙連接是一種單向運動。最近,Isakson[20]發(fā)現,IP3是以雙向流動的形成通過縫隙連接,位于內皮細胞上的IP3受體1能夠與來自血管平滑肌細胞的IP3結合而使內皮細胞發(fā)生反應,但來自內皮細胞的IP3經縫隙連接進入平滑肌細胞在與IP3受體結合前就被分解而不能使平滑肌細胞發(fā)生反應。

3.4 其他 cAMP或cGMP是重要的第二信使分子,在多種生物學過程中發(fā)揮重要作用。由于其分子量小且具有水溶性等特點而被認為可能是縫隙連接傳遞的重要介質,但目前尚無直接證據能夠證實這一點。

4 展 望

縫隙連接介導的細胞間信號傳遞在細胞之間的相互調節(jié)中具有重要的意義。它和細胞的旁分泌及自分泌一起,構成了細胞間相互調節(jié)的網絡。這對了解細胞間的相互調節(jié)機制,以及在病理條件下的變化具有重要的意義,并可能成為干預病變的新的靶點。但目前的研究尚處于起始階段,很多問題尚未清楚。如究竟有多少介質進行跨膜傳遞,縫隙連接通道如何進行調節(jié),以及介質進入另一細胞后的信號轉導過程如何,這些問題均有待進一步闡明。相信隨著研究的不斷深入以及新的研究方法的建立,這些問題可以逐步解決,從而為探索細胞間信號傳遞開拓出新的領域,并對干預其病理變化尋找新的靶點。

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