沈 慶,李 華,蘭四友,蔣幼凡,熊 剛

(1.重慶市第三人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科 400014;2.重慶醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科 400010;3.第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院心胸外科,重慶400038)

α1,3FUCTⅦ是一種糖鏈加工酶,能催化巖藻糖基轉(zhuǎn)移到糖蛋白糖鏈底物,它是產(chǎn)生Slex(又稱為唾液酸化的路易斯-X)的重要物質(zhì),大量文獻(xiàn)報道,Slex在大腸癌、胃癌、膀胱癌等腫瘤組織中呈明顯增強(qiáng)表達(dá)[1-3],并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。但α1,3FUCTⅦ與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系尚不十分清楚。本研究應(yīng)用 RT-PCR法檢測α1,3FUCTⅦ基因mRNA在肺癌組織、癌旁正常肺組織中的表達(dá),探討α1,3FUCTⅦ基因mRNA的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系,以及其在肺癌發(fā)展過程中可能的作用。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本 收集本院及協(xié)作單位2008年6月至2009年6月期間手術(shù)切除肺癌新鮮標(biāo)本92例(男52例,女40例),患者平均年齡(54±17)歲。其中腺癌36例,鱗癌30例,小細(xì)胞癌26例。癌旁正常肺組織選擇遠(yuǎn)離癌組織(＞5 cm)的正常支氣管黏膜和肺組織20例作為對照觀察。所有標(biāo)本投入液氮速凍之后,3 h內(nèi)轉(zhuǎn)移至-80℃低溫冰箱凍存。

1.2 試劑 Rever Tre Ace-a-逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TOYOBO公司,PCR System 9700購自 Applied Biosy Stems公司,PCR Mix Taq購自天跟公司。

1.3 RT-PCR法 取標(biāo)本 20～100 mg,以 TRNzol試劑提取總RNA。將2μg RNA置于 10μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,再行 PCR擴(kuò)增。根據(jù)已知α1,3FUCT Ⅶ基因序列由上海生物技術(shù)有限公司合成引物,上游:5′-CCC CGC AG CAA GTC TAT GA-3′,下游:5′-CCA CCC CTG CTT CCT GAC CT-3′(181 bp)。 GAPDH(內(nèi)參照)引物上游:5′-TG GGG TGA TGC TGG TGC TGA GT-3′,下游:5′-AG GTT TCT CCA GGCGGC ATG TC-3′(500 bp)。PCR反應(yīng)條件94℃預(yù)變性10 min;94℃變性45 s,63℃退火1 min,72℃延伸1 min。35個循環(huán);72℃終延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物10 g/TBE瓊脂糖凝膠電泳。溴化乙錠顯影,凝膠成像系統(tǒng)(UVITec公司)成像。Image-Pro Plus6.0軟件行半定量分析目的基因的相對表達(dá)量以目的條帶積分光密度(IOD)值與內(nèi)參照條帶IOD值的比值表示。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS12.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,所得數(shù)據(jù)以±s表示,兩組均數(shù)的比較采用t檢驗,兩組以上均數(shù)的比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

α1,3FUCTⅦ基因mRNA在肺癌組織中的表達(dá)(表 1,圖1、2)。α1,3FUCT Ⅶ基因 m RNA在肺癌組織中表達(dá)量為(0.67±0.15),在癌旁正常肺組織表達(dá)量為(0.45±0.11),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。其中在腺癌組織(0.79±0.19)中表達(dá)最強(qiáng),小細(xì)胞肺癌組織(0.68±0.17)中表達(dá)次之,鱗癌組織中表達(dá)(0.51±0.12)最弱,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。實驗中發(fā)現(xiàn),α1,3FUCTⅦ基因 mRNA在鱗癌組織中表達(dá)與癌旁正常肺組織表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。此外,α1,3FUCT Ⅶ基因mRNA表達(dá)與年齡、性別無關(guān)(P＞0.05)。與TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)類型有關(guān)(P＜0.05)。

表1 α1,3 FUCTⅦm RNA的表達(dá)與肺癌臨床和病理學(xué)特征的關(guān)系

圖1 α1,3 FUCTⅦmRNA在癌旁正常組織及鱗癌組織中的表達(dá)

圖2 α1,3 FUCTⅦmRNA在腺癌組織及小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)

3 討 論

FUCT是一類負(fù)責(zé)將GDP巖藻糖中的巖藻糖基(Fucose)轉(zhuǎn)移至N-乙酰氨基乳糖單鏈(GlcNAc)上并以α-巖藻糖苷鍵相連接的酶。其主要作用底物是糖蛋白的O-糖或乳糖系、新乳糖系的糖脂,也可以是N-糖鏈,產(chǎn)物主要是含有α-巖藻糖基的血型抗原,如A、B、O血型抗原和 Lewis糖鏈抗原(Le)。FUCTⅦ是巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(fucosyltransferase,FUCT)的一個亞型,它是Ⅱ類跨膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu),N端有14個氨基酸位于細(xì)胞質(zhì),接著為19個氨基酸的疏水跨膜區(qū)以及位于高爾基體內(nèi)的309個氨基酸催化結(jié)構(gòu)域。1994年 Sasaki等[4]在 THP-C細(xì)胞cDNA文庫中將其克隆出來。其cDNA全長為1.7 kb,開放閱讀框架編碼 342個氨基酸,相對分子質(zhì)量為39.2×103,基因定位在染色體9q34.3。目前的研究發(fā)現(xiàn),巖藻糖基化參與多種生物學(xué)過程,包括組織生長、血管生成、細(xì)胞增殖、黏附、侵襲和腫瘤轉(zhuǎn)移。至少有18種人基因疾病起因于N-糖基化蛋白改變[5-7]。Prorok等[8]的研究顯示:高親和力的選擇素和其配體的相互作用需要core2基礎(chǔ)的0聚糖,它的合成需要巖藻糖轉(zhuǎn)移酶Ⅶ(FUCTⅦ)和磺基轉(zhuǎn)移酶,以core1前提為底物進(jìn)行修飾,最終形成側(cè)鏈為 Slex的core2基礎(chǔ)的 0聚糖。而FUCTⅦ及其產(chǎn)物Slex對肝癌細(xì)胞H7721的轉(zhuǎn)移能力起至關(guān)重要的作用[9]。

眾所周知,α巖藻糖轉(zhuǎn)移酶大家族目前已發(fā)現(xiàn)有9種亞型,其中FUCT-Ⅲ(Lewis血型,Le)主要分布在腎、膽囊及乳汁中。FUCT-Ⅳ(類髓型)產(chǎn)物為Lex及ⅥM-2,存在于 5～10周胚胎各組織,在成人僅在髓系組織及大腦中表達(dá)。FUCT-Ⅵ(血漿型)主要存在于肝臟和血漿,其產(chǎn)物為Lex和Slex。其中FUCT-Ⅵ催化合成Slex的能力可以是FUCTⅦ的1.5倍[10]。FUCTⅦ(白細(xì)胞型)在白細(xì)胞中表達(dá),只能以唾液酸化的糖鏈為底物,合成Slex[11]。前期的研究發(fā)現(xiàn),FUCTⅦ的活性可以直接影響Slex的表達(dá)量并進(jìn)而影響肝癌細(xì)胞的黏附、趨化性遷移和侵襲等轉(zhuǎn)移表型[12]。用佛波脂(TPA,一種促癌劑,也是PKC蛋白激酶激活劑)處理Jurkat細(xì)胞觀察FUCTⅦ及其產(chǎn)物Slex表達(dá)的改變,結(jié)果發(fā)現(xiàn)處理后的細(xì)胞增加FUCTⅦ的轉(zhuǎn)錄及其產(chǎn)物Slex的表達(dá),并能誘導(dǎo)合成 E-選擇素配體合成[13]。

本文研究發(fā)現(xiàn),α1,3FUCTⅦ基因m RNA在肺癌組織中表達(dá)量明顯高于癌旁正常組織,其中在腺癌組織表現(xiàn)最強(qiáng)。而且α1,3FUCTⅦ基因mRNA表達(dá)與 TNM 分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)類型有關(guān),與年齡、性別無關(guān)。表明α1,3FUCTⅦ基因mRNA表達(dá)可能與肺癌的發(fā)生及轉(zhuǎn)移相關(guān)。

然而,本實驗僅限于對肺癌組織標(biāo)本中α1,3FUCTⅦ基因m RNA進(jìn)行研究,驗證其與臨床病理因素的關(guān)系,至于α1,3FUCTⅦmRNA在肺癌中的作用機(jī)制尚未涉及,肺癌組織中的Lewis抗原與α1,3FUCTⅦmRNA關(guān)系如何尚不清楚。因此,還需要進(jìn)一步研究在肺癌組織中Lewis抗原與其合成酶FUCT之間的關(guān)系,并結(jié)合相關(guān)細(xì)胞系及臨床結(jié)果來證實這種Lewis抗原及相關(guān)的糖鏈加工酶是否能成為腫瘤轉(zhuǎn)移的新的生物學(xué)指標(biāo)和防止腫瘤轉(zhuǎn)移可能的治療靶點(diǎn)。

[1] Paganuzzi M,Bobbio B,Marroni P,et al.Prognostic role of serum sialyl Lewisx(CD15s)in colorectal cancer[J].Oncology,2003,65(1):52.

[2] Sumikura S,Ishigami S,Natsugoe S,et al.Disseminated cancer cells in theblood and expression of sialylated antigen in gastric cancer[J].Cancer letters,2003,200(1):77.

[3] Numahata K,Satoh M,Handa K,et al.Sialosyl-Le(x)expression defines invasive and metastatic properties of bladder carcinoma[J].Cancer,2002,94(3):673.

[4] Sasaki K,Kurata K,Funayama K,et al.Expression cloning of a novel alpha1,3-fucosyltransferase that is involved in biosynthesis of the sialyl lewis X carbonhydrate determinants in leukocytes[J].J Biol Chem,1994,269(20):14730.

[5] Jacken J,Komrower L.Congenital disorder of glycosylayion(CDG):it′s all in it[J].J Inherit Metab Dis,2003,26(2):99.

[6] Marquardt T,Denecke J.Congenital disorder of glycosylation:review of their molecular bases.Clinical presentations and specific therapies[J].Eur J Pediatr,2003,162(6):359.

[7] Freeze HH,Aebi M.Altered glycan structure:the molecular basis of congenital disorders of glycosylation[J].Curr Opin Struct Biol,2005,36(5):490.

[8] Prorok HM,Notel F,Mathiew S,et al.N-glycans of Core2β(1,6)-N-acetylglucosaminy-l transferase-I(C2GnT-1)but not those ofα(1.3)-fucosyltransferase-Ⅶ(FUCTⅦ)are required for the synthesis of function P-Selectin Glycoprotein Ligand(PSGL-1)Effects on P-,L-,and E-selectin binding[J].Biochem J,2005,391(Pt3):491.

[9] Hiraiwa N,Dohi T,Kawakami KN,et al.Suppression of sialyl Lewis X expression and E-selectin-mediated cell ad hesion in cultured human lymphoid cells by transfectio of antisense cDNA of an alphal-3 fucosyl transferas(FUCTⅦ)[J].J Biol Chem,1996,271(49):31556.

[10]Togayachi A,Kudo Y,Ikehara Y,et al.Up-regulation o Lewis enzyme(α1.3-FUCT Ⅲ)and plasma-typeα1.3-fu cosyl transferase(FUCTⅥ)expression of sialyl lewis X antigen in non-small cell lung cancer[J].Int J Cancer 1999,35:70.

[11]Narimatsu H.Human fucosy transferase:tissue distribu tion of blood group antigens,cancer-associated antige and fucosl transferase[J].Tanpakushitsu kakusan koso 1998,43(16):2394.

[12]Liu F,Qi HL,Chen HL.Regulation of differentiation an proliferation induce on Lewis antigens,αfucosyl transfer ase and metastatic potential in hepatocarcinoma cell[J]Br JCancer,2001,84(11):1556.

[13]Knibbs RN,Craig RA,Natsuka S,et al.Thefucosyltrans ferase FUCTⅦregulates E-selectin ligand synthesis i human T cells[J].JCell Biol,1996,133(4):911.