張超 曲偉棟 趙華強(qiáng)

低氧狀態(tài)下聯(lián)合培養(yǎng)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞及其誘導(dǎo)來源的內(nèi)皮細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究

張超 曲偉棟 趙華強(qiáng)

目的在低氧條件下聯(lián)合培養(yǎng)兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（Bone Marrow Stromal Cell，BMSC）及由其誘導(dǎo)而來的內(nèi)皮細(xì)胞（Endothelial Cell，EC），觀察并探討低氧狀態(tài)及EC對(duì)BMSC增殖的影響。方法從兔骨髓中分離獲得BMSC，體外培養(yǎng)擴(kuò)增后取部分向EC誘導(dǎo)。實(shí)驗(yàn)分4組：①BMSC常氧培養(yǎng)組；②BMSC低氧培養(yǎng)組；③BMSC+EC常氧聯(lián)合培養(yǎng)組；④BMSC+EC低氧聯(lián)合培養(yǎng)組。通過觀察細(xì)胞的形態(tài)、增殖能力等了解低氧條件及EC對(duì)BMSC生長的影響。結(jié)果BMSC可誘導(dǎo)為EC，EC與BMSC混合生長良好。MTT法檢測顯示，低氧培養(yǎng)組的細(xì)胞增殖能力明顯高于常氧培養(yǎng)組（P＜0.01），但相同條件下的BMSC單獨(dú)培養(yǎng)組和BMSC+EC聯(lián)合培養(yǎng)組間的細(xì)胞增殖能力沒有顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)論在一定時(shí)間內(nèi)，低氧培養(yǎng)可以促進(jìn)BMSC的增殖；BMSC來源的EC不能促進(jìn)BMSC的增殖。

骨髓基質(zhì)干細(xì)胞 內(nèi)皮細(xì)胞 低氧 聯(lián)合培養(yǎng)

骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）已成為骨組織工程理想的種子細(xì)胞來源之一[1]，體外培養(yǎng)BMSC并向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)的技術(shù)已日趨成熟[2]。研究發(fā)現(xiàn)，快速而有效的血管化是組織工程骨移植成活的關(guān)鍵[3-4]。在血管形成方面，內(nèi)皮細(xì)胞（EC）是重要的參與細(xì)胞，有學(xué)者嘗試將成骨細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)，以期獲得組織工程骨的快速血管化[5-7]。但成骨細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞獲取困難，不易分離培養(yǎng)，易老化。

在骨損傷后和骨修復(fù)的初期，成骨再生反應(yīng)是在低氧環(huán)境中進(jìn)行的[8]。本實(shí)驗(yàn)將自體BMSC向EC誘導(dǎo)，并與BMSC聯(lián)合培養(yǎng)，以了解低氧條件及EC對(duì)BMSC增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器設(shè)備

低糖DMEM培養(yǎng)基（Hyclon公司，美國）；胎牛血清 （杭州四季青公司，中國）；Percoll分離液（Pharmacia公司，瑞典）；二甲基亞砜DMSO、四甲基偶氮唑藍(lán)MTT（Amersico公司，美國）；M199培養(yǎng)基（Invitrogen公司，美國）；兔源性CD34抗體、免疫組化ABC檢測試劑盒 （北京博奧森生物技術(shù)有限公司，中國）；低氧恒溫CO2培養(yǎng)箱（Rsbiotech公司，英國）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

3周齡新西蘭大白兔，雌雄不限，無菌條件下取股骨，去除干骺端后用完全DMEM-LG培養(yǎng)基（青霉素100 U/mL、鏈霉素100 U/mL，10%FBS）反復(fù)沖洗骨髓腔，離心棄上清后制成細(xì)胞懸液，加入到另一離心管內(nèi)（含等量的1.077 g/mL的Percoll分離液），2 000 r/min離心20 min，緩慢吸取中間乳白色云霧狀懸浮的單個(gè)核細(xì)胞層，加入完全DMEM-LG培養(yǎng)基，接種于塑料培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，3 d天后首次換液，以后每2～3 d更換一次培養(yǎng)基，約7～10 d后細(xì)胞融合成單層時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)和鑒定

將第1代骨髓基質(zhì)干細(xì)胞消化，離心去上清，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶內(nèi)，更換內(nèi)皮誘導(dǎo)培養(yǎng)液（M199基礎(chǔ)培養(yǎng)基、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子VEGF 10 μg/L、堿性成纖維細(xì)胞生長因子bFGF 2 μg/L），3 d后首次換液；以后每2～3 d換液，持續(xù)誘導(dǎo)。融合成單層細(xì)胞后用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液消化傳代，所獲得的細(xì)胞CD34+，呈內(nèi)皮細(xì)胞屬性。

1.3 MTT法檢測低氧條件下BMSC和EC聯(lián)合培養(yǎng)的細(xì)胞增殖情況

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分4組：①BMSC常氧培養(yǎng)組；②BMSC低氧培養(yǎng)組；③BMSC+EC常氧聯(lián)合培養(yǎng)組；④BMSC+ EC低氧聯(lián)合培養(yǎng)組。各組細(xì)胞均以1×103個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每組6孔；聯(lián)合培養(yǎng)組中BMSC與EC比例為1∶1，培養(yǎng)基為完全DMEM-LG培養(yǎng)基；每2～3 d更換一次培養(yǎng)基，培養(yǎng)7 d；低氧培養(yǎng)組的氧濃度為1%。4組細(xì)胞每隔24 h行MTT檢測，共7次

1.3.2 MTT法檢測各組細(xì)胞增殖情況

吸除孔內(nèi)培養(yǎng)基，用不含F(xiàn)BS的DMEM-LG培養(yǎng)基沖洗后，更換培養(yǎng)基為含0.5%FBS的DMEMLG培養(yǎng)基，同時(shí)每孔加入0.5%的MTT 20 μL，繼續(xù)在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h后，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，于每孔中加入150 μL的DMSO，振蕩10 min，在分光光度儀490 nm波長下測定吸光值（OD值）。所測OD值用（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，繪制各組細(xì)胞生長曲線，采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，在SPSS11.0上進(jìn)行方差分析和q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSC形態(tài)學(xué)觀察

剛接種的BMSC呈球形，懸浮于培養(yǎng)液中并逐漸貼壁展開，3 d后大部分BMSC在培養(yǎng)瓶底貼壁散在分布；首次換液后，見貼壁細(xì)胞多呈三角形和多角形；培養(yǎng)7 d后，細(xì)胞集落迅速增多，呈漩渦狀排列，細(xì)胞形態(tài)為長梭形或立方狀，單層均勻緊密排列（圖1）。傳代后，細(xì)胞形態(tài)更加單一，5～6 d即可鋪滿瓶底，若繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞呈復(fù)層生長，逐漸老化死亡。

圖1 BMSC原代培養(yǎng)第7天（倒置相差顯微鏡，100×）

2.2 BMSC誘導(dǎo)為EC

原代細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)3 d后，可見細(xì)胞貼壁，但未完全展開，5～7 d后，細(xì)胞貼壁，部分形成集落，細(xì)胞小，呈梭形；傳代后，細(xì)胞逐漸變大，由梭形變?yōu)槎嘟切危▓D2），CD34+，胞漿棕黃色，提示細(xì)胞為內(nèi)皮細(xì)胞屬性（圖3）。

2.3 聯(lián)合培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

BMSC和EC聯(lián)合培養(yǎng)，可見兩種細(xì)胞混合生長，相容性好，BMSC體積較大，EC體積較?。▓D4）。

2.4 MTT法檢測細(xì)胞增殖情況

各組細(xì)胞數(shù)量在第1、2天無明顯增加，第3天細(xì)胞數(shù)量開始明顯增加，至第6天一直處于快速增長期，至第7天生長趨勢開始變緩（表1）（圖5）。第1、2天各組細(xì)胞間增殖能力無顯著性差異 （P＞0.05），第3～7天，低氧培養(yǎng)的細(xì)胞增殖能力均明顯高于常氧培養(yǎng)（P＜0.01）。連續(xù)培養(yǎng)的7 d內(nèi)，單獨(dú)培養(yǎng)和聯(lián)合培養(yǎng)的細(xì)胞增殖無顯著性差異（P＞0.05）。

圖2 EC第1代培養(yǎng)第3天（倒置相差顯微鏡，100×）

圖3 傳代后EC呈CD34+（倒置相差顯微鏡，100×）

圖4 低氧條件下BMSC+EC聯(lián)合成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)第7天（倒置相差顯微鏡，100×）

圖5 4組培養(yǎng)細(xì)胞體外培養(yǎng)的生長曲線

3 討論

種子細(xì)胞是組織工程化骨構(gòu)建的首要環(huán)節(jié)和基本要素，BMSC具有來源廣泛、取材方便、增殖快、生長穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)[9]，已成為應(yīng)用最廣泛的種子細(xì)胞來源之一，體外培養(yǎng)并成骨誘導(dǎo)的技術(shù)已日趨成熟，Maniatopoulos等[10]首次報(bào)道鼠BMSC在體外能形成骨樣組織。

近年來,應(yīng)用組織工程化骨修復(fù)骨缺損取得了較大進(jìn)展，但大塊骨的缺損仍無法修復(fù)，其中一個(gè)重要原因就是血管化的問題。組織工程化骨體積越大，越需要更多的血管為其提供營養(yǎng)，血管化是骨形成的重要基礎(chǔ)[11]。因此，如何快速血管化成為組織工程化骨應(yīng)用于臨床的關(guān)鍵。血管化的形式包括血管生成和血管形成[12-13]，這兩種形式均可通過誘導(dǎo)因子促進(jìn)，其中具有代表性的是血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）。VEGF在血管化中起著重要作用，但在體內(nèi)的半衰期十分短暫，若直接放置于人工骨中，無法達(dá)到促血管形成的作用。因此，骨組織工程應(yīng)用VEGF的策略大致有兩大類：一是放置緩釋系統(tǒng)[14-15]；二是應(yīng)用可持續(xù)釋放VEGF的細(xì)胞，如EC等。EC既能直接參與血管化，還能持續(xù)釋放VEGF，促進(jìn)血管化[16]。體外成骨細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)可以促進(jìn)成骨和血管形成[17],但成骨細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞獲取困難，不宜分離培養(yǎng)，且培養(yǎng)時(shí)易老化。因此，本實(shí)驗(yàn)以自體BMSC和由其誘導(dǎo)而來的EC聯(lián)合培養(yǎng)，以此來觀察EC對(duì)BMSC增殖的影響。結(jié)果提示，BMSC與誘導(dǎo)獲得的EC聯(lián)合培養(yǎng)，對(duì)BMSC的增殖無明顯促進(jìn)作用。

表1 4組細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的平均OD值（490 nm）

在骨損傷后，周圍的微環(huán)境由于血供的減少會(huì)發(fā)生低氧，在損傷的中心區(qū)域會(huì)降低到2%以下，所以骨組織損傷后的成骨再生反應(yīng)是在低氧環(huán)境中進(jìn)行的。本實(shí)驗(yàn)采用1%的低氧條件進(jìn)行培養(yǎng)，與常氧條件相比，在一定時(shí)間內(nèi)能明顯促進(jìn)BMSC的增殖。

但需要注意的是，骨損傷修復(fù)的體內(nèi)環(huán)境比體外單純低氧環(huán)境要復(fù)雜得多，大塊組織工程化骨的快速高效的血管化是其臨床應(yīng)用的重要基礎(chǔ)和成功保證，尚需在這方面進(jìn)行更多的深入研究。

[1] Fleming JE Jr,Cornell CN,Muschler GF.Bone cells and matrices in orthopedic tissue engineering[J].Orthop Clin North Am,2000, 31(3):357-374.

[2] Caplan AI,Reuben D,Haynesworth SE.Cell-based tissue engineering therapies:the influence of whole body physiology[J].Adv Drug Deliv Rev,1998,33(1-2):3-14.

[3] Logeart-Avramoglou D,Anagnostou F,Bizios R,et al.Engineering bone:challenges and obstacles[J].Cell Mol Med,2005,9(1):72-84.

[4] Dong J,Kojima H,Uemura T,et al.In vivo evaluation of a novel porous hydroxyapatite to sustain osteogenesis of transplanted bone marrow-derived osteoblastic cells[J].Biomed Mater Res,2001,57 (2):208-216.

[5] Zhu WN,Yang ZM,Li XQ,et al.Expermental study on rabbit periosteal osteoblasts and renal vascular endothelial cells in direct co-culture in vitro [J].Chin J Repara Reconstr Surg,2002,16(5): 307-310.

[6] Rui G,Wang ZS,Lu G,et al.Study on biological behavior of osteoblast and vascular endothelial cell culture[J].Chin J Repara Reconstr Surg,2004,18(4):327-330.

[7] Ding J,Zeng BF,Zhang XL.Growth plate chondrocytes promoting VEGF expression of BMSCs[J].Chin J Orthop Trauma,2005,7 (11):1055-1058.

[8] Gordillo GM,Sen CK.Revisiting the essential role of oxygen in wound healing[J].Am J Surg,2003,186(3):259-263.

[9] Stanworth SJ,Newland AC.Stem cells:progress in research and edging towards the clinical setting[J].Clin Med,2001,1(5):378-382.

[10] Maniatopoulos C,Sodek J,Melcher AH.Bone formation invitro by stromal cells obtained from bone marrow of young adultrats [J]. Cell Tussue Res,1988,254(3):317-330.

[11] Collin-Osdoby P.Role of vascular endothelial cells in bone biology [J].Cell Biochem,1994,55(3):304-309.

[12] Risau W.Mechanisms of angiogenesis[J].Nature,1997,386(6626): 671-674.

[13] Carmeliet P.Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis[J]. Nat Med,2000,6(4):389-395.

[14] Gu F,Amsden B,Neufeld R.Sustained delivery of vascular endothe-lial growth factor with alginate beads[J].J Control Release, 2004,96(3):463-472.

[15] Murphy WL,Peters MC,Kohn DH,et al.Sustained release of vascular endothelial growth factor from mineralized poly(lactideco-gly-colide)scaffolds for tissue engineering[J].Biomaterials, 2000,21(24):2521-2527.

[16] Wener N,Nickenig G.Clinical and therapeutical implications of EPC biology in atherosclerosis[J].Cell Mol Med,2006,10(2):318-332.

[17] 朱偉南,楊志明,李秀群,等.兔骨膜成骨細(xì)胞與腎血管內(nèi)皮細(xì)胞間接共培養(yǎng)的體外實(shí)驗(yàn)研究[J].中國修復(fù)重建外科雜志,2002,16 (5):307.

[18] Lee JW,Bae SH,Jeong JW,et al.Hypoxia-inducible factor(HIF-1)alpha:its protein stability and biological function[J].Exp Mol Med,2004,36(1):1-12.

[19] Liu LX,Lu H,Luo Y,et al.Stabilization of vascular endothelial growth factor mRNA by hypoxia inducible factor 1 [J].Biochem Biophys Res Commun,2002,291(4):908-914.

Experimental Study of Bone Marrow Stromal Cells and Induced Endothelial Cells in Co-Culture under Hypoxia

ZHANG Chao,QU Weidong,ZHAO Huaqiang.

Department of Oral and Maxillofacial, Shandong University School of

Stomatology,Jinan 250012,China.Corresponding author:ZHAO Huaqiang.

Objective To investigate the influence of hypoxia and co-culture of endothelial cells (EC)induced from BMSC and autologous bone marrow stromal cells(BMSC)on the proliferation of BMSC.Methods The rabbit BMSC were isolated and were induced into endothelial cells.These cells were divided into four groups.①BMSC group cultured under normoxia;②BMSC group cultured under hypoxia;③BMSC+EC group co-cultured under normoxia;④BMSC+EC group co-cultured under hypoxia.Inverted microscope and MTT method were applied to observe the effects of hypoxia and induced autologous EC on the cellular compatibility of BMSC. Results Endothelial cells could be induced from BMSC.Inverted microscope showed a cellular compatible growing status of BMSC and EC. The ability of proliferation of groups cultured under hypoxia were stronger than groups cultured under normoxia (P＜0.01),but there was no significant difference between BMSC groups and BMSC+EC groups(P＞0.05).Conclusion The hypoxia can increase the proliferation of BMSC.While the endothelial cells induced from BMSC can not.

Bone marrow stromal cell;Endothelial cell;Hypoxia;Co-culture

Q813.1+1

A

1673-0364（2010）06-0315-04

2010年8月30日，

2010年9月21日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2010.06.004

250012 山東省濟(jì)南市 山東大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面外科(張超 曲偉棟 趙華強(qiáng))。

趙華強(qiáng)。