宗憲磊 姜篤銀 蔡景龍 陳瑩

應用噬菌體隨機12肽庫篩選TβRⅡ特異性序列

宗憲磊 姜篤銀 蔡景龍 陳瑩

目的從噬菌體隨機12肽庫中篩選TGF-β1Ⅱ型受體（TGF-beta receptorⅡ，TβRⅡ）的特異性序列，評估其對瘢痕疙瘩成纖維細胞的作用。方法以人TGF-β1單克隆抗體為靶，在噬菌體隨機12肽庫中進行4輪生物篩選；應用ELISA法挑選結(jié)合活性較好的單克隆噬菌體，進行DNA序列分析；MTT法評估TGF-β1單克隆噬菌體對瘢痕疙瘩成纖維細胞的生物學效應。結(jié)果測序共獲得5種類似于TβRⅡ的特異性序列。MTT結(jié)果顯示其中有3種噬菌體模擬肽能夠抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖。結(jié)論具有TβRⅡ特異性序列的噬菌體模擬肽能夠抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖。

噬菌體隨機12肽庫 轉(zhuǎn)化生長因子-βⅡ型受體 瘢痕疙瘩成纖維細胞

創(chuàng)傷愈合與瘢痕形成密切相關(guān)，異常的創(chuàng)傷愈合常會導致增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的形成。研究表明，瘢痕疙瘩具有一定程度的腫瘤特性，防治仍十分困難，是目前研究的熱點和難點[1-2]。轉(zhuǎn)化生長因子-beta1（Transforming growth factor-β1,TGF-β1）是一種多功能的生長因子，與創(chuàng)面愈合和瘢痕形成密切相關(guān)[3-4]。阻斷TGF-β1的信號通路是一種有效防治瘢痕疙瘩的辦法[3-7]。TGF-βⅡ型受體 （TGF-β receptorⅡ，TβRⅡ）是TGF-β1的重要受體[5-6]，與TGF-β1的功能密切相關(guān)。噬菌體隨機肽庫是呈現(xiàn)特定長度的各種不同外源性多肽的噬菌體集合物。在M13噬菌體PⅢ基因的一側(cè)隨機插入特定長度的外源性的隨機寡核苷酸，可以在噬菌體表面呈現(xiàn)出與PⅢ蛋白融合的隨機多肽，構(gòu)成完整的肽庫。該方法已在受體阻斷劑和激動劑的篩選和模擬、多肽疫苗和藥物的研發(fā)等多個領(lǐng)域得到廣泛應用[8-13]，如已從噬菌體隨機肽庫中篩選獲得 CTGF[8]、EGF、VEGF和KGF[11-13]等多種生長因子的抗原表位。本實驗擬從噬菌體隨機12肽庫中篩選出與TGF-β1單克隆抗體結(jié)合的TβRⅡ的特異性序列，并將其與瘢痕疙瘩成纖維細胞表面的TβRⅡ競爭性結(jié)合天然的TGF-β1，探討其對瘢痕疙瘩成纖維細胞的作用，為瘢痕疙瘩防治開拓新的思路。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

噬菌體隨機 12肽庫試劑盒 （E.coli ER2738，NEB公司，美國），TGF-β1單克隆抗體（R&D公司，美國），TGF-β1 ELISA試劑盒（Sunbio公司，上海），IPTG（Merk公司，德國），PEG-8000（Amresco公司，美國），X-gal、BSA、MTT、DMSO（Sigma公司，美國），DMEM、FBS（Hycolone公司，美國），酶標儀（Bio-Rad公司，美國），恒溫細菌搖床（江蘇海門其林醫(yī)用儀器廠，江蘇），高速低溫離心機（Hettich公司，德國），超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，蘇州），細菌培養(yǎng)箱（上海歐邁科學儀器有限公司，上海），細胞培養(yǎng)箱（Heraeus公司，德國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 篩選

以人TGF-β1單克隆抗體包被96孔板，濕盒中4℃孵育過夜。0.5%的BSA 4℃封閉1 h。TBST洗板6次，加肽庫，室溫溫和搖動1 h，TBST洗板10次，洗脫緩沖液 （0.2 mol/L Glycine-HCl，pH 2.2，0.1% BSA）洗脫結(jié)合的噬菌體，中和緩沖液（1 mol/L Tris-HCl，pH 9.1）快速中和洗脫物。對洗脫物進行擴增用于下一輪篩選。同樣方法對每輪的洗脫物再進行3輪篩選，富集能夠與TGF-β1單克隆抗體特異性結(jié)合的噬菌體模擬肽。對每一輪的洗脫物和擴增物進行滴度測定，計算每一輪篩選的噬菌體的產(chǎn)出/投入比，評估噬菌體的回收率。

1.2.2 噬菌體擴增

E.coli ER2738宿主菌劃線接種于平板，倒置平板37℃培養(yǎng)過夜，挑取宿主菌單菌落于5 mL LB培養(yǎng)基中，37℃劇烈震蕩培養(yǎng)過夜，將培養(yǎng)物1∶100稀釋于LB培養(yǎng)基，加入生物篩選洗脫物，37℃劇烈震蕩培養(yǎng)5 h。10 000 g，4℃離心10 min，棄沉淀，上清液中加入PEG8000/NaCl，4℃過夜沉淀。10 000 g，4℃離心15 min，棄上清液，10 000 g，4℃離心30 sec，去上清，沉淀懸于1 mL TBS中，加入PEG8000/NaCl，冰育1 h。10 000 g，4℃離心10 min，棄上清液，沉淀懸于100 μL TBS/0.02%NaN3中，獲得擴增的噬菌體。

1.2.3 噬菌體滴度測定

接種宿主菌單菌落于5 mL LB培養(yǎng)基中，37℃劇烈震蕩培養(yǎng)5 h。應用LB對噬菌體進行10倍系列稀釋。分別取各稀釋度的噬菌體上清液10 μL與200 μL宿主菌培養(yǎng)液快速震蕩混勻，室溫孵育5 min，加入3 mL 45℃的上層瓊脂中，快速振蕩混勻，立即傾倒在37℃預溫的LB/IPTG/X-gal平皿上，室溫冷卻5 min，37℃倒置培養(yǎng)過夜。含有噬菌體的菌斑顯藍色，計數(shù)藍斑個數(shù)，計算出噬菌體滴度（Plaque forming units，Pfu）。

1.2.4 單克隆噬菌體擴增和ELISA檢測

對第4輪的生物篩選物進行滴度測定，隨機挑選噬菌體藍斑，進行擴增，調(diào)整至2.0×1013pfu/mL。應用ELISA方法和人TGF-β1免疫測定試劑盒檢測單克隆噬菌體的結(jié)合力。2倍稀釋TGF-β1標準品，共獲得7個稀釋濃度（4 000～62.5 pg/mL）。添加各個稀釋濃度的TGF-β1標準品或單克隆噬菌體，室溫孵育2 h。應用洗滌緩沖液洗滌3次。添加抗人TGF-β1生物素，室溫孵育1 h。應用洗滌緩沖液洗滌3次。添加HRP，室溫避光孵育30 min。添加50 μL終止液。30 min內(nèi)應用酶標儀測定其490 nm的吸光度值。

1.2.5 單克隆噬菌體DNA純化和序列分析

噬菌體沉淀懸于100 μL碘化物緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，1 mmol/L EDTA，4 mol/L NaI），加入250 μL乙醇，室溫溫育10 min，使蛋白保存于溶液中，DNA沉淀，離心10 min，應用70%乙醇洗沉淀，沉淀重懸于30 μL無菌雙蒸水中。噬菌體DNA和-96 gⅢ測序引物一起送北京華大基因有限公司，進行染料示蹤的雙脫氧法自動測序。應用核酸Blast系統(tǒng)檢測模擬肽DNA的相似性。

1.2.6 細胞系和培養(yǎng)方法

采用組織塊培養(yǎng)法獲得第3～5代瘢痕疙瘩成纖維細胞，應用含10%FBS的DMEM于37℃、5% CO2條件下進行培養(yǎng)[14]，所有培養(yǎng)基添加100 U/mL的青霉素和100 μg/mL的鏈霉素。

1.2.7 細胞增殖檢測

共設6組：噬菌體M13對照組和5組噬菌體模擬肽組（No.1～5）實驗組，每組均設陰性參照。應用MTT方法定量測定瘢痕疙瘩成纖維細胞活細胞的數(shù)量。將取得的第3～5代瘢痕疙瘩成纖維細胞消化，重懸于含10%FBS的DMEM，接種于96孔板，每孔3 000個細胞。應用不含血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)未融合的細胞24 h，使細胞同步化。換液，分別應用DMEM/0.5%FBS/PBS（陰性對照），DMEM/0.5%FBS/噬菌體M13（1012pfu/ml，1011pfu/ml和1010pfu/ml），含0.5%FBS的DMEM/5種噬菌體模擬肽 （No.1～5，1012pfu/mL，1011pfu/mL和1010pfu/mL）培養(yǎng)48 h，在培養(yǎng)的最后4 h添加MTT。移除培養(yǎng)基，每孔添加150 μL DMSO，應用酶標儀測定570 nm的吸光度值。

1.3 統(tǒng)計分析

實驗結(jié)果以（平均值±標準差）表示，應用SPSS 16.0系統(tǒng)進行單因素方差分析法和Dunnet's檢測方法分析各組間的差異顯著性。P＜0.05時，差異具有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 噬菌體富集

在4輪生物篩選過程中每次投入的噬菌體的總量均為2×1012pfu，經(jīng)過4輪生物淘選，獲得的能夠與TGF-β1單克隆抗體特異性結(jié)合的噬菌體的總量從1.36×106pfu（第 1輪）逐漸增加至 1.14×1010pfu（第4輪）。TGF-β1單克隆抗體特異性噬菌體的產(chǎn)率從6.80×10-7（第1輪）逐漸增加至5.70×10-3（第4輪）。通過4輪生物篩選，獲得的噬菌體的特異性逐漸增強，總量逐漸增高，產(chǎn)出率逐漸增高，說明與TGF-β1單克隆抗體特異性結(jié)合的噬菌體模擬肽獲得了富集（表 1）。

表 1生物淘選的噬菌體的回收率

2.2 ELISA

通過ELISA檢測，獲得TGF-β1的標準品吸光度值的曲線（圖1）。對4輪生物篩選后獲得的單克隆噬菌體進行ELISA檢測，獲得的單克隆噬菌體全部有良好的結(jié)合活性（吸光度值均≥0.246），吸光度值均高于250 ng/mL的TGF-β1標準品的吸光度值。證明生物篩選獲得的單克隆噬菌體與TGF-β1單克隆抗體均具有較好的結(jié)合活性（表2）。

圖1 TGF-β1的濃度-吸光度值

2.3 模擬肽DNA的序列分析

對22種單克隆噬菌體進行擴增，應用碘緩沖液提取法能夠較好提取并純化單克隆噬菌體DNA，進行瓊脂糖凝膠電泳，可獲得較好的DNA條帶。測序共獲得10種特異性的DNA序列，其中有5種序列與TβRⅡ及其前體相似（表2）。

2.4 細胞增殖檢測

陰性參照和噬菌體M13對照組之間無顯著性差異（P＞0.05），在陰性參照和3組低濃度噬菌體模擬肽組（No.2，1011pfu/mL和1010pfu/mL，No.3和No.5，1010pfu/mL）之間也不存在顯著性差異（P＞0.05）。但是陰性參照和其他噬菌體模擬肽組之間存在顯著性差異（P＜0.05），并呈劑量依賴性，其中3種噬菌體模擬肽（No.3～5）可抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖（圖2）。

圖2 噬菌體模擬肽（No.1～5）對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖活性影響的MTT檢測

表2模擬肽的DNA序列分析結(jié)果

3 討論

TGF-β1是目前已知的與腫瘤關(guān)系極為密切的生長因子，其Ⅱ型受體（TβRⅡ）在TGF-β1信號傳導、生物學效應等方面具有重要作用，TβRⅡ的變化影響著TGF-β1的功能[15]。研究表明，TGF-β1及TβRⅡ也與瘢痕疙瘩的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，TβRⅡ是TGF-β1促使瘢痕疙瘩形成的重要通路。與正常皮膚相比，瘢痕疙瘩表達高水平的TβRⅡ[8]，可能是瘢痕疙瘩具有一定程度腫瘤特性的重要因素[7-9,16-17]。蔡景龍[18]依據(jù)瘢痕疙瘩的臨床表現(xiàn)、研究及治療進展等方面，提出。姜篤銀等[19]提出瘢痕疙瘩成纖維細胞具有凋亡抗性，可能是瘢痕疙瘩生長旺盛、具有侵襲性，并且不隨時間消退的原因，這均與TGF-β1及其Ⅱ型受體有關(guān)。

本研究通過四輪生物篩選，TGF-β1特異性的噬菌體獲得富集，ELISA的結(jié)果顯示篩選的單克隆噬菌體均與TGF-β1單克隆抗體具有較好的結(jié)合力。測序和序列分析共獲得5種類似于TβRⅡ的特異性序列。生物篩選過程是以TGF-β1單克隆抗體為靶，TβRⅡ的出現(xiàn)，可能是由于TGF-β1與其特異性的受體TβRⅡ有一定的相似性，或者二者具有能夠互相結(jié)合的空間構(gòu)象，這些序列也能夠與TGF-β1單克隆抗體相結(jié)合。MTT檢測數(shù)據(jù)顯示，有4種噬菌體模擬肽能夠抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖，并呈劑量依賴性。這可能是通過與野生型的TβRⅡ競爭性結(jié)合TGF-β1，中和了部分TGF-β1，降低TGF-β1的有效濃度，干擾了TGF-β1信號通路，從而抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖。通過部分阻斷TGF-β1的信號通路，可能有助于了解瘢痕疙瘩的發(fā)生和發(fā)展的機制，探討防治瘢痕疙瘩的方法，可能有助于改善瘢痕疙瘩的腫瘤方面的臨床表現(xiàn)（如促進其消退，避免浸潤性生長，避免復發(fā)等）。今后需進行信號通路方面的深入研究，并進行動物實驗來加以驗證。

本實驗從噬菌體隨機12肽庫中篩選了5種類似于TβRⅡ的特異性序列，并證實其中有3種能夠抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖，提示我們通過干擾TGF-β1信號通路，可能有助于深入了解TGF-β1信號通路與瘢痕疙瘩的發(fā)生和發(fā)展的關(guān)系，選擇TβRⅡ的特異性序列，有望研制出防治瘢痕疙瘩的新型藥物，為防治瘢痕疙瘩提供了新的策略。

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Isolation of Specific Sequence of TGF-β ReceptorⅡ Using a Phage 12-mer Display Peptide Library

ZONG

Xianlei1,JIANG Duyin2,CAI Jinglong1,CHEN Ying1.
1 Plastic Surgery Hospital,Chinese Academy Medical Sciences,Beijing 100144,China;2 Institute of Tissue Engineering of Shandong University,Jinan 250033,China.Corresponding author:JIANG Duyin,CAI Jinglong.

Objective To isolate the specific sequence of TGF-β receptorⅡ (TβRⅡ)from a phage 12-mer display peptide library and to evaluate their effects on keloid fibroblasts. Methods A phage 12-mer display peptide library was screened for four rounds using monoclonal anti-human TGF-β1 as the target.ELISA was performed to select monoclonal phages with good association for DNA sequencing.MTT assay was used to detect the effects of monoclonal phages on keloid fibroblasts.Results Five specific sequences were obtained,which were similar to TβRⅡ.The results of MTT assay showed that three of the five phage model peptides could inhibit proliferation of keloid fibroblasts. Conclusion Phage model peptides with specific sequences of TβRⅡcan inhibit proliferation of keloid fibroblasts.

Phage 12-mer display peptide library; TGF-β receptorⅡ; Keloid fibroblast

Q781

A

1673－0364（2010）06－0323－04

2010年11月9日，

2010年11月26日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2010.06.006

國家自然科學基金資助項目（30772258，81071560）。

100144 北京市 中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院整形外科醫(yī)院（宗憲磊，蔡景龍，陳瑩）；250033 山東省濟南市 山東大學組織工程研究所（姜篤銀）。

姜篤銀，蔡景龍。