趙 燕，陳 芳，李建科，廖 斌，涂勇剛

(1.南昌大學(xué) 生物質(zhì)轉(zhuǎn)化教育部工程研究中心，江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；3.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌 330045)

微生物多糖韋蘭膠生產(chǎn)工藝優(yōu)化

趙 燕1,2，陳 芳1,2，李建科1,2，廖 斌1,2，涂勇剛3

(1.南昌大學(xué) 生物質(zhì)轉(zhuǎn)化教育部工程研究中心，江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；3.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌 330045)

探討韋蘭膠的生產(chǎn)條件，主要包括生產(chǎn)菌株、發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵工藝條件三方面。通過繪制菌體生長曲線，了解此菌種的生長情況，初步確定二級種子的培養(yǎng)時(shí)間。通過單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)，得出韋蘭膠的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：蔗糖40g/L、酵母膏3g/L、K2HPO4·7H2O 5g/L、MgSO4·7H2O 2g/L、FeSO4·7H2O 1mg/L、CaCl20.5g/L；此條件下，韋蘭膠產(chǎn)率由7.31g/L上升到17.23g/L。最佳發(fā)酵工藝條件為：接種齡18h、接種量0.5%、裝液量40mL(250mL搖瓶)、初始pH7.0、搖床轉(zhuǎn)速220r/min、培養(yǎng)溫度30℃、培養(yǎng)時(shí)間72h，在此條件下，韋蘭膠產(chǎn)率達(dá)20.64g/L。

微生物多糖；韋蘭膠；發(fā)酵

微生物多糖是細(xì)菌、真菌等微生物在生長代謝過程中產(chǎn)生的生物聚合物[1]。與動植物多糖相比，微生物多糖生產(chǎn)周期短，受外界環(huán)境因素的影響相對較小，產(chǎn)量及質(zhì)量都相對穩(wěn)定，可以在控制條件的情況下實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)[2]。以高黏度、水溶性為特征的微生物膠是近年來利用現(xiàn)代生物技術(shù)開發(fā)的新型微生物多糖，可作為增稠劑、懸浮劑、黏附劑或保水劑，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、石油和水泥等領(lǐng)域，具有很高的商業(yè)價(jià)值，尤其是黃原膠、結(jié)冷膠和韋蘭膠這3種微生物膠[3-4]。

韋蘭膠(welan gum，welan，編號S-130)，也叫威蘭膠、威倫膠或維蘭膠，是Alcaligenes sp. ATCC 31555產(chǎn)生的胞外多糖，被認(rèn)為是繼黃原膠、結(jié)冷膠之后最具市場前景的第3代微生物膠。研究表明韋蘭膠屬于典型的假塑性流體，具有良好的增稠性、懸浮性、乳化性，尤其是具有耐高溫、耐酸堿、耐鹽性能[5-6]。韋蘭膠水溶液對熱穩(wěn)定，在溫度升高至149℃時(shí)，其黏度基本不變，其耐溫極限值比黃原膠高20～30℃。韋蘭膠水溶液對酸、堿穩(wěn)定，其黏度在pH2～13范圍內(nèi)基本不受影響；對鹽的穩(wěn)定性也高，使其可作為增稠劑、懸浮劑、乳化劑、穩(wěn)定劑和保水劑應(yīng)用于工、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的諸多方面。

國外早在20世紀(jì)80、90年代就開始研究韋蘭膠的

結(jié)構(gòu)、構(gòu)象、性質(zhì)和應(yīng)用[5-18]，但未見對其發(fā)酵和生產(chǎn)方面的報(bào)道。我國于近年開始進(jìn)行韋蘭膠方面的研究[1,19-26]，韋蘭膠搖瓶發(fā)酵的產(chǎn)率大多在17g/L左右，僅有少數(shù)報(bào)道其膠產(chǎn)率超過20g/L；上罐發(fā)酵韋蘭膠的產(chǎn)率普遍高于搖瓶發(fā)酵的水平。但迄今為止，韋蘭膠在國內(nèi)還沒有實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，美國Kelco公司仍是全球惟一的韋蘭膠生產(chǎn)供應(yīng)商。本實(shí)驗(yàn)主要對韋蘭膠生產(chǎn)菌株、發(fā)酵培養(yǎng)基配方及發(fā)酵工藝條件三方面進(jìn)行探索性研究，以期為韋蘭膠的進(jìn)一步開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

菌株Alcaligenes sp. ATCC31555購于美國菌種保藏中心。

斜面培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉3、蛋白胨4、KCl 5；種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖15、蛋白胨7、KCl 5；發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30、蛋白胨3、CaCl20.5、FeSO4·7H2O 0.001、K2HPO4·7H2O 0.3、MgSO4· 7H2O 0.5。

1.2 儀器與設(shè)備

AR1140分析天平、SPS401F電子天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司；恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；303A-4數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱 上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；凈化工作臺 上海新苗醫(yī)療機(jī)械制造有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博訊醫(yī)療設(shè)備廠；752N紫外-可見分光光度計(jì)、PHS-3B精密pH計(jì)上海精密科學(xué)儀器有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱 南京實(shí)驗(yàn)儀器廠；Brookfield DV-Ⅱ+Pro 黏度計(jì) 美國Brookfield公司。

1.3 方法

1.3.1 菌體生長曲線的繪制

250mL帶擋板的搖瓶裝液量50mL，接種量1%，220r/min、30℃振蕩培養(yǎng)。在0、5、10、15、20、25h時(shí)分別取發(fā)酵液樣品，測定菌體濃度(OD660nm)、總糖質(zhì)量濃度、還原糖質(zhì)量濃度，繪制生長曲線。

1.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選

1.3.2.1 單因素試驗(yàn)

培養(yǎng)基成分固定FeSO4·7H2O 1mg/L、CaCl20.5g/L，以韋蘭膠產(chǎn)率為主要評價(jià)指標(biāo)，發(fā)酵液黏度為參考指標(biāo)，考察不同碳源、氮源、K2H P O4·7 H2O用量、MgSO4·7H2O用量對韋蘭膠發(fā)酵的影響。

1.3.2.2 正交試驗(yàn)

固定培養(yǎng)基組分中FeSO4·7H2O 和CaCl2質(zhì)量濃度分別為1mg/L和0.5g/L，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以蔗糖質(zhì)量濃度(A)、酵母膏質(zhì)量濃度(B)、K2HPO4·7H2O質(zhì)量濃度(C)、MgSO4·7H2O質(zhì)量濃度(D)為因素，各取3水平，以韋蘭膠的產(chǎn)率為指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)。

1.3.3 發(fā)酵工藝條件優(yōu)化

以韋蘭膠產(chǎn)率為主要指標(biāo)、發(fā)酵液黏度為參考，考察種齡及接種量、培養(yǎng)基裝液量、初始pH值對韋蘭膠發(fā)酵的影響。

1.3.4 培養(yǎng)方法

一級種子培養(yǎng)：250mL搖瓶內(nèi)裝50mL種子培養(yǎng)基，接種活化后的斜面菌種兩環(huán)，搖床轉(zhuǎn)速220r/min，培養(yǎng)溫度30℃，培養(yǎng)時(shí)間24h。

二級種子培養(yǎng)：50mL種子培養(yǎng)基(250mL搖瓶)，接種量1%，轉(zhuǎn)速220r/min，30℃培養(yǎng)15h。

發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的種子液按1%的接種量接入裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL搖瓶中培養(yǎng)、30℃，220r/min，培養(yǎng)72h。

1.3.5 測定方法

還原糖的測定：3,5-二硝基水楊酸(DNS)法；總糖的測定：苯酚-硫酸法；菌體生長量的測定：比濁法；發(fā)酵液酸度的測定：用pH計(jì)進(jìn)行測定；發(fā)酵液黏度的測定：用黏度計(jì)(4號轉(zhuǎn)子，轉(zhuǎn)速60r/min)測定；韋蘭膠膠產(chǎn)率的測定：采用乙醇沉淀法測定。稱取適量發(fā)酵液，加入2倍體積的95%乙醇沉淀析出韋蘭膠。過濾，烘干，稱質(zhì)量，提取的韋蘭膠質(zhì)量與發(fā)酵液體積之比即膠產(chǎn)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌體生長曲線

圖1 菌體生長曲線Fig.1 Growth curve of ATCC31555 in seed medium

由圖1可知，菌種在經(jīng)過10h的延滯期后到達(dá)對數(shù)生長期。15h后菌體生長較為穩(wěn)定，20h后菌體生長進(jìn)入衰亡期。最佳種齡一般處于對數(shù)生長期的末期，由此預(yù)測本實(shí)驗(yàn)菌種的最佳種齡(即二級種子培養(yǎng)時(shí)間)應(yīng)該在15h左右。

總糖與還原糖的變化趨勢與菌體的生長趨勢保持一

致。在菌體生長的延滯期，總糖與還原糖質(zhì)量濃度變化不大，進(jìn)入對數(shù)生長期后，總糖與還原糖質(zhì)量濃度都下降。但總體而言，在整個(gè)菌體生長過程中耗糖量不大，糖質(zhì)量濃度不是該菌生長的主要限制性因素。

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選

2.2.1 單因素試驗(yàn)

2.2.1.1 碳源的選擇

分別選用葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、木薯淀粉水解液作碳源進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，考察不同碳源對韋蘭膠合成的影響。如圖2所示，菌株在以蔗糖為碳源時(shí)發(fā)酵液的黏度與膠產(chǎn)率均最高，以葡萄糖或木薯淀粉水解液為碳源也可獲得較高的膠產(chǎn)率，但發(fā)酵液黏度偏低。而在以可溶性淀粉為碳源時(shí)，菌株幾乎不產(chǎn)膠，發(fā)酵液黏度和產(chǎn)膠率均為零，說明該菌水解可溶性淀粉的能力極低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明蔗糖為最佳碳源。

圖2 碳源對韋蘭膠產(chǎn)率和黏度的影響Fig.2 Effect of carbon source on the yield and viscosity of Welan gum

2.2.1.2 氮源的選擇

圖3 氮源對韋蘭膠產(chǎn)率和黏度的影響Fig.3 Effect of nitrogen source on the yield and viscosity of Welan gum

分別采用蛋白胨、玉米漿、酵母膏、硝酸銨、硫酸銨、尿素作氮源，考察其對膠產(chǎn)率和發(fā)酵液黏度的影響。從圖3可知，菌株在以酵母膏為氮源時(shí)，發(fā)酵液的黏度和膠產(chǎn)率均為最高；以蛋白胨或玉米漿為氮源也可獲得較高的膠產(chǎn)率，但發(fā)酵液黏度明顯偏低；以無機(jī)氮為氮源，膠產(chǎn)率和發(fā)酵液黏度均不理想。這可能是由于有機(jī)氮源比無機(jī)氮源營養(yǎng)成分豐富，可以提供發(fā)酵所需要的其他營養(yǎng)，如氨基酸和維生素等。

2.2.1.3 K2HPO4·7H2O用量的選擇

磷有利于糖的代謝，因此它能促進(jìn)微生物的生長繁殖；但當(dāng)磷過量時(shí)，許多產(chǎn)物的合成又會受到抑制，故磷用量的選擇非常必要。由圖4可知，在K2HPO4·7H2O質(zhì)量濃度0～10g/L的范圍內(nèi)，綜合考慮韋蘭膠產(chǎn)率和發(fā)酵液黏度，認(rèn)為其在發(fā)酵培養(yǎng)基中的質(zhì)量濃度以5g/L左右為宜。

圖4 K2HPO4·7H2O質(zhì)量濃度對韋蘭膠產(chǎn)率和黏度的影響Fig.4 Effect of K2HPO4·7H2O concentration on the yield and viscosity of Welan gum

2.2.1.4 MgSO4·7H2O用量的選擇

圖5 MgSO4·7H2O質(zhì)量濃度對韋蘭膠產(chǎn)質(zhì)量率和黏度的影響Fig.5 Effect of MgSO4·7H2O concentration on the yield and viscosity of Welan gum

鎂是許多重要酶的激活劑和啟動器，因此其用量的選擇也非常關(guān)鍵。由圖5可知，M g S O4·7 H2O質(zhì)量濃度為3g/L左右時(shí)韋蘭膠產(chǎn)率最高，發(fā)酵液黏度適中。

2.2.2 正交試驗(yàn)

按1.3.2.2節(jié)設(shè)計(jì)進(jìn)行正交試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Design and results of orthogonal experiments

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 2 Variance analysis of orthogonal experiments

由表1可知，影響韋蘭膠產(chǎn)率各因素的主次順序?yàn)榻湍父噘|(zhì)量濃度＞蔗糖質(zhì)量濃度＞K2HPO4·7H2O質(zhì)量濃度＞MgSO4·7H2O質(zhì)量濃度。最佳培養(yǎng)基配方為A2B2C2D1，結(jié)合培養(yǎng)基中的固定組分FeSO4·7H2O 1mg/L、CaCl20.5g/L，即最佳培養(yǎng)基配方為：蔗糖40g/L、酵母膏3g/L、K2HPO4·7H2O 5g/L、MgSO4·7H2O 2g/L、FeSO4·7H2O 1mg/L、CaCl20.5g/L。按此配方進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，韋蘭膠產(chǎn)率達(dá)17.23g/L。由表2方差分析可知，蔗糖和酵母膏質(zhì)量濃度對膠產(chǎn)率的影響都具有顯著性。

2.3 發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化

2.3.1 種齡及接種量的選擇

圖6 種齡對韋蘭膠產(chǎn)率和黏度的影響Fig.6 Effect of seed age on the yield and viscosity of Welan gum

通常，接種齡以菌體處于生命力極為旺盛的對數(shù)生長期后期，且培養(yǎng)液中菌體量將達(dá)到最高峰時(shí)較為合適；接種量的大小取決于生產(chǎn)菌種在發(fā)酵罐中生長繁殖的速度[27]。本實(shí)驗(yàn)將種齡控制在12～24h，接種量控制在0.5%～4%的范圍內(nèi)，綜合考察對膠產(chǎn)率和發(fā)酵液黏度的影響。結(jié)果如圖6～7所示，最佳種齡為18h，最佳接種量為0.5%。綜合圖6與圖1分析，種齡處于菌體對數(shù)生長后期有利于發(fā)酵生產(chǎn)；當(dāng)種齡超過穩(wěn)定期進(jìn)入衰亡期后，韋蘭膠的生物合成量下降。

圖7 接種量對韋蘭膠產(chǎn)率和黏度的影響Fig.7 Effect of inoculation amount on the yield and viscosity of Welan gum

2.3.2 裝液量的選擇

韋蘭膠的發(fā)酵是好氧的，此類發(fā)酵過程中在沒有自動控制溶氧系統(tǒng)的情況下通常采用較少裝液量和提高搖床轉(zhuǎn)速來控制溶氧。本實(shí)驗(yàn)將裝液量控制在20、40、60、80、100mL(250mL搖瓶)，綜合考察膠產(chǎn)率和發(fā)酵液黏度，結(jié)果如圖8所示，最佳裝液量為40mL。

圖8 裝液量對韋蘭膠產(chǎn)率和黏度的影響Fig.8 Effect of medium volume on the yield and viscosity of Welan gum

2.3.3 初始pH值的選擇

將培養(yǎng)基的初始pH值分別調(diào)節(jié)至5、6、7、8、9，分別進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)并測定韋蘭膠的膠產(chǎn)率和發(fā)酵液黏度，結(jié)果如圖9所示，培養(yǎng)基初始p H值對ATCC31555產(chǎn)膠和膠黏度都有明顯的影響，較優(yōu)的初始pH值為7。

圖9 初始pH值對韋蘭膠產(chǎn)率和黏度的影響Fig.9 Effect of initial pH on the yield and viscosity of Welan gum

3 結(jié) 論

以Alcaligenes sp. ATCC31555為生產(chǎn)菌株，通過對營養(yǎng)條件和環(huán)境條件的優(yōu)化，確定最優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)基為：蔗糖40g/L、酵母膏3g/L、K2HPO4·7H2O 5g/L、MgSO4·7H2O 2g/L、FeSO4·7H2O 1mg/L、CaCl20.5g/L；驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，采用優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基，韋蘭膠產(chǎn)率可達(dá)17.23g/L。最佳發(fā)酵環(huán)境條件為：接種齡18h、接種量0.5%、裝液量40mL(250mL搖瓶)、初始pH7.0、搖床轉(zhuǎn)速220r/min、培養(yǎng)溫度30℃、培養(yǎng)時(shí)間72h；在此條件下，韋蘭膠產(chǎn)率高達(dá)20.64g/L。

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Fermentation Processing of Microbial Polysaccharide Welan Gum

ZHAO Yan1,2，CHEN Fang1,2，LI Jian-ke1,2，LIAO Bin1,2，TU Yong-gang3
(1. Engineering Research Center of Biomass Conversion, Ministry of Education, Nanchang University, Nanchang 330047, China；2. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China；3. College of Food Science and Engineering, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China)

Optimal preparation conditions such as strain, fermentation medium and fermentation processing parameters were explored. The growth of strain and second stage of seed were achieved by the growth curve of ATCC31555 in medium. The optimal fermentation medium for preparing Welan gum were explored by single factor and orthogonal experiments to be 40 g/L sucrose, 3 g/L yeast extract, 5 g/L K2HPO4·7H2O, 2 g/L MgSO4·7H2O, 1 mg/L FeSO4·7H2O and 0.5 g/L CaCl2. The yield of Welan gum was increased from 7.31 to 17.23 g/L by using the improved medium. The optimal fermentation conditions were the seed age of 18 hours, inoculation amount of 0.5% (V/V), medium volume of 40 mL in 250 mL flask, pH 7.0, shaking speed of 220 r/min, fermentation temperature of 30 ℃ and fermentation time of 72 h. Under the optimal fermentation conditions, the yield of Welan gum was up to 20.64 g/L.

microbial polysaccharide；Welan gum；fermentation

TS201.3

A

1002-6630(2010)23-0219-05

2010-08-15

食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自由探索課題(SKLF-TS-200822)

趙燕(1980—)，女，助理研究員，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工與生物質(zhì)轉(zhuǎn)化。E-mail：zhaoyan@ncu.edu.cn