(煙臺大學 海洋學院,山東 煙臺 264005)

多糖分子修飾的方法主要有硫酸化、羧乙基化、羧甲基化以及雙基團衍生化等[1]。其中,多糖的硫酸化修飾由于具有獨特的作用而成為研究的熱點。硫酸化多糖的抗病毒作用在艾滋病治療上得到證實[2]。硫酸化修飾后的茯苓多糖(pachymaran)能溶于水,并增強了機體的免疫功能,具備抗腫瘤、抗病毒等活性多糖的硫酸化為多糖帶來了新的活性和功能[3]。

κ-卡拉膠(KC)具有優(yōu)良的熱可逆凝膠化、抗蛋白凝結(jié)、親水無毒等獨特性能,在食品、化工和包裝等方面應(yīng)用廣泛[4]。特別是近年來在醫(yī)藥和生物工程領(lǐng)域的應(yīng)用,更引起了人們的研究興趣。近來研究發(fā)現(xiàn)卡拉膠本身就具有特殊的醫(yī)藥療效,它對許多重要病毒病原(如皰疹病毒、HIV、粘液病毒、棒狀病毒等) 具有廣譜抑制活性,還對免疫系統(tǒng)具有持續(xù)性作用,它是有效的抗胃蛋白酶活、抗?jié)?、抗凝血、抗栓物質(zhì)[5]。而硫酸基對卡拉膠的生物活性具有關(guān)鍵作用。Carlucci等[6]的研究表明,如將多糖上的硫酸根除去,則卡拉膠抑制皰疹病毒復(fù)制的作用隨之消失。Yamada等[7]發(fā)現(xiàn)硫酸化修飾的κ-卡拉膠的抗HIV活性較κ-卡拉膠原糖增加。本實驗室從角叉菜(Chondrus Ocellatus)中采用水提醇沉法提取角叉菜卡拉膠,對其進行分級處理得到κ-卡拉膠(KC),采用氯磺酸-吡啶法對κ-卡拉膠進行硫酸化修飾。并對角叉菜卡拉膠及其硫酸化衍生物對細胞的免疫活性進行初步比較研究,探討硫酸化修飾對κ-卡拉膠生物活性的影響,以期通過分子修飾技術(shù)提高角叉菜卡拉膠的生物功效。

1 材料與方法

1.1 κ-卡拉膠的制備

干燥角叉菜粉碎后,經(jīng)熱水浸提(80℃)、離心、KCl分級、濃縮、乙醇沉析、復(fù)溶、透析、沉析、洗滌、真空干燥等工藝得到角叉菜多糖κ-卡拉膠,經(jīng)液相檢測測定的κ-卡拉膠的分子質(zhì)量為 1 771 721 u,硫酸化修飾的卡拉膠的分子質(zhì)量為1 737 953 u。

1.2 試劑和儀器

RPMI1640培養(yǎng)液：美國 HyClone公司(批號：AMC15824),加10%小牛血清、雙抗、HEPES;小牛血清：美國HyClone公司;MTT(噻唑藍),Sigma公司產(chǎn)品;DMSO：AMRESCO分裝;氯磺酸、吡啶、甲酰胺、刀豆蛋白等均為分析純或生化試劑;昆明種小鼠(BALB / c),雄性,體質(zhì)量32 g,購自山東省實驗動物中心。

ELX-800酶聯(lián)免疫檢測儀：美國 Bio-Tek Instruments INC.;LabTeach UV-1100型紫外分析儀：美國萊伯泰科公司;Shimadzu IR-400型紅外光譜儀：日本島津株式會社。

2 實驗方法

2.1 角叉菜κ-卡拉膠的硫酸化修飾

采用氯磺酸- 吡啶法[8]對角叉菜κ-卡拉膠進行硫酸化修飾。在帶有攪拌裝置和冷凝裝置的三頸燒瓶中加入預(yù)冷的無水吡啶,并將燒瓶置于冰鹽浴中攪拌,再將氯磺酸于40 min內(nèi)逐滴加入。滴加完畢后撤去冰鹽浴,室溫下加入1.0 g角叉菜κ-卡拉膠與30 mL甲酰胺懸液,60℃下攪拌2 h,將三頸燒瓶置于100 mL冰水中結(jié)束反應(yīng),用1 mol/L NaOH中和至pH 7.5。加入3倍體積的無水乙醇,靜置、離心,洗滌3次,將沉淀自來水透析3 d,對蒸餾水透析1 d。真空冷凍干燥得到角叉菜κ-卡拉膠硫酸化衍生物。

2.2 κ-卡拉膠的硫酸基含量測定

用氯化鋇-明膠法[9]測定硫酸化前后κ-卡拉膠的硫酸基含量。

2.3 紫外光譜分析

將多糖樣品配成 0.1 %水溶液,在 LabTeach UV-1100型紫外分析儀上對200～500 nm 區(qū)間進行掃描。

2.4 硫酸化κ-卡拉膠的免疫活性研究

2.4.1 SKC對正常小鼠脾淋巴細胞增殖活性的影響

小鼠脫頸處死,無菌取脾,將脾放入已消毒的平皿中,用 RPMI-1640培養(yǎng)液反復(fù)沖脾,碾磨獲取脾細胞懸液,裂解紅細胞,離心洗滌,最后用含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)液制成細胞密度為 2×106個/mL的脾細胞懸液,備用。用完全培養(yǎng)液配制 50 mg/L ConA(刀豆蛋白)溶液備用。實驗組每孔加入不同濃度的卡拉膠,使其最終質(zhì)量濃度分別為25、50、100、200、400 mg/L,于 96孔培養(yǎng)板中,每孔加入100 μL 細胞懸液,再加 100 μL 培養(yǎng)液(空白對照)、10 mg/L ConA(陽性對照)及含有不同濃度的以培養(yǎng)基配制的樣品溶液,振蕩混勻后,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 72 h。終止培養(yǎng)前 4 h,每孔加入MTT(5 g/L)20 μL,混勻后繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后,小心吸棄上清液,每孔加入150 μL二甲基亞砜,振蕩10 min使紫色結(jié)晶完全溶解,以調(diào)零復(fù)孔調(diào)零(以培養(yǎng)液調(diào)零),在酶標儀上測各孔的吸光值(測定波長570 nm,參比波長630 nm)

淋巴細胞增殖率(%)=多糖刺激孔吸光度值/空白對照孔吸光度值×100

2.4.2 SKC對小鼠單核-巨噬細胞RAW264.7增殖作用的影響

取處于對數(shù)生長期的小鼠單核-巨噬細胞RAW264.7,胰酶消化收集細胞,用含 10%胎牛血清的培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度為5×105個/mL,加入96孔板,100 μL/孔,貼壁 2 h 后,換新鮮培養(yǎng)液 100 μL,再加100 μL 培養(yǎng)液(空白對照)、LPS(脂多糖)陽性對照(終濃度為 2 mg/L)、及含有不同濃度的樣品溶液,于37℃、5%的CO2條件下培養(yǎng)24 h。

吸棄上層培養(yǎng)液,補充新鮮的培養(yǎng)液100 μL/孔,同時加入5 g/L的MTT 20μL/孔,同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,輕輕吸棄上清,加入150 μL DMSO震蕩10 min,充分混勻,置室溫 10 min后,用酶標儀在570 nm處測定吸光值。吸光度越大,表明免疫活性越高。

2.4.3 SKC對小鼠腹腔巨噬細胞產(chǎn)生NO的影響

采用亞硝酸鹽法測定[10],取處于對數(shù)生長期的RAW264.7細胞,調(diào)整細胞密度為2.5×105個/mL。96孔板每孔接種 100 μL,每個樣品設(shè)置 6個重復(fù)孔。37°C,5%CO2培養(yǎng)條件下,培養(yǎng)24 h。按照需要的濃度加入100 μL樣品,脂多糖溶液(陽性對照,其終質(zhì)量濃度為4 mg/L),空白對照。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,從每個孔取 50μL 培養(yǎng)上清液到一個新的 96孔板中,測540 nm處的吸光度,每個濃度6 個復(fù)孔,重復(fù)3次實驗。

2.5 統(tǒng)計方法

用SPSS11.5 統(tǒng)計軟件中的One Way ANOVA進行組間數(shù)據(jù)的比較,用t檢驗進行兩組數(shù)據(jù)之間的比較。

3 實驗結(jié)果

3.1 κ-卡拉膠硫酸化修飾后硫酸基含量

本實驗采用較溫和的條件,即氯磺酸與吡啶質(zhì)量比 1 ：3,反應(yīng)溫度 60℃,時間 1.5 h, 對角叉菜λ-卡拉膠進行硫酸化修飾,采用氯化鋇-明膠法將樣品數(shù)據(jù)代入硫酸基標準曲線回歸方程(見圖1),可得硫酸化修飾前后樣品的硫酸基質(zhì)量分數(shù)分別為 21.64%±1.36%,32.58%±0.92%;紫外掃描結(jié)果顯示在200～400 nm無吸收(圖2),說明樣品不含蛋白質(zhì)和核酸。

圖1 硫酸基含量標準曲線Fig.1 The standard curve of O-SO3-

圖2 KC和SKC紫外光圖譜Fig.2 Ultraviolet spectra of KC and SKC

3.2 對正常小鼠脾淋巴細胞增殖活性的影響

由圖3可見25～400 mg/ L的KC和SKC均能刺激小鼠 T淋巴細胞增殖反應(yīng),均有促增殖作用,其中SKC對小鼠脾淋巴細胞促增殖作用更強。與陽性對照 ConA(10 mg/ L)誘導的 T淋巴細胞增殖相比,KC在25～100 mg/ L濃度范圍內(nèi),對淋巴細胞的促增殖作用不如陽性對照,而 SKC對淋巴細胞增殖的促進作用則優(yōu)于陽性對照組。在實驗濃度范圍100～400 mg/ L內(nèi),SKC對T淋巴細胞促增殖作用均優(yōu)于KC (P＜0.01),并且本實驗濃度范圍內(nèi)SKC顯示出小鼠淋巴細胞促增殖作用的劑量依賴關(guān)系。實驗結(jié)果提示硫酸化卡拉膠對小鼠免疫系統(tǒng)中的細胞免疫存在較佳的促進作用,效果要優(yōu)于卡拉膠。

圖3 KC和SKC對淋巴細胞的增殖作用Fig.3 Effects of KC and SKC on the proliferation of mouse peritoneal macrophage

3.3 對小鼠單核-巨噬細胞RAW264.7增殖的影響

由圖4可見,與對照組比較,KC及SKC低劑量(25 mg/ L)組未能明顯提高單核-巨噬細胞RAW264.7細胞的增殖活性,在質(zhì)量濃度大于(100 mg/L)兩者均能促進單核-巨噬細胞 RAW264.7增殖(P＜0.05),而且在100～400 mg/ L范圍內(nèi)SKC的作用均要顯著強于KC (P＜0.01)。質(zhì)量濃度在50～400 mg/L之間時,SKC可顯著的促進小鼠巨噬細胞 RAW264.7增殖,其作用的強弱隨濃度變化,隨著濃度的提高,促進作用不斷增強,表明SKC對巨噬細胞RAW264.7增殖活性呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。SKC的增殖效果較顯著,在高濃度時甚至優(yōu)于陽性藥LPS。

圖4 KC和SKC對巨噬細胞的增殖作用Fig.4 Effects of KC and SKC on the proliferation of mouse peritoneal macrophage

3.4 對小鼠腹腔巨噬細胞產(chǎn)生NO的影響

將吸光度代入標準曲線方程y= 0.007x+ 0.1269,R2= 0.9972,求得NO的含量,NO含量測定結(jié)果表明,與空白對照相比,KC和SKC的高低劑量組均能提高巨噬細胞產(chǎn)生NO量(P＜ 0.05),其中SKC促進巨噬細胞產(chǎn)生NO的活性較KC更強(P＜0.01),并呈一定的劑量依賴性。如圖5所示,KC樣品在25～400 mg/L的濃度范圍內(nèi),促使巨噬細胞產(chǎn)生NO低于LPS陽性對照組;而SKC質(zhì)量濃度大于100 mg/L時,其效果就優(yōu)于LPS陽性對照組。

圖5 KC 和SKC對小鼠腹腔巨噬細胞NO合成的誘導作用Fig.5 Nitric oxide production by murine peritoneal macrophages induced by KC and SKC

4 討論

本研究發(fā)現(xiàn),κ-卡拉膠經(jīng)硫酸化修飾后,對代表細胞免疫的淋巴 T細胞和作為機體免疫系統(tǒng)中重要的免疫細胞的巨噬細胞的增殖作用比κ-卡拉膠原糖得到了增強,另外,SKC在誘導巨噬細胞NO的生成方面比KC也有所增加,說明SKC能很好地介導激活的巨噬細胞,具有潛在的抗腫瘤活性和免疫調(diào)節(jié)作用。這些活性的增加,可能是因為多糖的生物活性與其結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)緊密相關(guān),而κ-卡拉膠在硫酸酯化后,所帶硫酸基團的空間位阻和靜電排斥效應(yīng)改變了κ-卡拉膠原來的空間結(jié)構(gòu),增加了糖鏈的屈伸度,提高了水溶性,從而引起生物活性的改變。

SKC除了對腫瘤細胞具有直接的細胞毒作用外,還能通過調(diào)節(jié)機體免疫功能發(fā)揮抗腫瘤作用,克服了化療藥物在抗腫瘤的同時對機體免疫功能的影響,具有一定的開發(fā)前景。

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