譚 志,馬玉彬,邵明瑜,張志峰

(1.中國(guó)海洋大學(xué) 海洋生物遺傳育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266003; 2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 繼續(xù)教育學(xué)院,山東 青島 266109)

硫化物對(duì)于多數(shù)生物的毒害作用表現(xiàn)在：它可以抑制線粒體電子傳遞鏈細(xì)胞色素氧化酶的活性[1],從而阻止有氧呼吸的進(jìn)行,進(jìn)而導(dǎo)致生物體的死亡。近年來,人們發(fā)現(xiàn)一些沿岸底棲生物具有耐受和代謝硫化物的能力,并推測(cè)一種類似于細(xì)菌硫醌氧化還原酶(Sulfide：quinone oxidoreductase,SQR)的蛋白參與這一過程[2],有毒的硫化物可在其催化下被氧化形成硫代硫酸鹽或亞硫酸鹽等低毒或無毒的產(chǎn)物,此氧化過程中產(chǎn)生的電子通過泛醌進(jìn)入氧化呼吸鏈,最終參與ATP的合成,提供有機(jī)體能量[3,4]。SQR的功能及作用原理最早在原核生物中被闡述,對(duì)于真核生物,Vande Weghe等[5]于1999年首次在粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中得到該酶的基因序列并對(duì)其蛋白定位和酶特性進(jìn)行了研究。2008年 Ursula Theissen等[6]首次在多細(xì)胞真核生物沙中利用釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)表達(dá)系統(tǒng)獲得了具有活性的 SQR,并進(jìn)一步對(duì)其酶活性及保持酶活性所必需的幾個(gè)保守的氨基酸進(jìn)行了研究,然而有關(guān)與SQR相互作用的上下游分子的研究,目前尚未見報(bào)道。

單環(huán)刺 (Urechis unicinctus),俗稱海腸子,隸屬于 蟲動(dòng)物門(Echiuroidea),刺 屬(Urechis),為東亞地區(qū)沿海泥沙岸潮間帶下區(qū)及潮下帶淺水區(qū)中生存的底棲生物[7]。對(duì)于單環(huán)刺 硫代謝相關(guān)領(lǐng)域的研究,目前已在組織細(xì)胞學(xué)特性[8]、體腔液中血紅素的組成[9]以及呼吸代謝酶活性[10]等方面有了報(bào)道。本研究使用本實(shí)驗(yàn)室已體外原核表達(dá)并獲得的具有活性的帶有六聚組氨酸標(biāo)簽的單環(huán)刺 6His-SQR,采用His-pulldown技術(shù)和毛細(xì)管液相色譜-離子肼質(zhì)譜技術(shù),篩選和初步定性了與單環(huán)刺 SQR相互作用的蛋白質(zhì),為深入探討單環(huán)刺 硫化物代謝機(jī)制提供研究資料。

1 材料與方法

1.1 材料

單環(huán)刺 購(gòu)自青島市四方路海產(chǎn)品市場(chǎng);Escherichia coliBL21(DE3)菌株、pET-28a載體均由本實(shí)驗(yàn)室保存; Ni2+-NTA His-Bind Resins購(gòu)自Novagen公司; 輔酶Q2購(gòu)自Sigma公司; 色譜級(jí)乙腈(acetonitrile)、甲酸購(gòu)自美國(guó) Fisher公司; 測(cè)序級(jí)胰蛋白酶(Trypsin)購(gòu)自美國(guó)Roche公司; 其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純以上。

1.2 方法

1.2.1 單環(huán)刺 6His-SQR的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

含單環(huán)刺sqr全長(zhǎng)cDNA的陽(yáng)性菌株在含卡納霉素(30 mg/L)的 LB培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)劑異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactopyr,IPTG)至終濃度1 mmol/L,37 ℃,誘導(dǎo)表達(dá)5 h后,4 ℃,2 655g離心10 min收集菌體,用20 mL PBS重懸,在冰浴中超聲破碎,直到溶液變澄清。于4 ℃、15 294g離心10 min,收集沉淀即得包涵體形式的6His- SQR。

取包涵體溶于變性液(8 mol/L 尿素,10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0),0.1 mol/L 磷酸鈉,1 mmol/Lβ-巰基乙醇)中,4 ℃溶解過夜,離心收集上清。透析去除β-巰基乙醇,用Ni2+-NTA純化6His-SQR蛋白,收集洗脫液。SDS-PAGE分析鑒定洗脫液蛋白組分。Brandford法檢測(cè)蛋白含量后,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 單環(huán)刺 6His-SQR復(fù)性及酶活測(cè)定

4℃下,將蛋白洗脫液滴加至復(fù)性緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0),5 mmol/L 還原型谷胱甘肽(Reduced glutathione,GSH),0.5 mmol/L 氧化型谷胱甘肽(Oxidized glutathione,GSSG),0.4 mol/LL-精氨酸,1 mmol/L 苯甲基磺酰氟(Phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF),蛋白濃度50 mg/L)中,靜置24 h使之充分復(fù)性。然后15 294g離心20 min,上清液中可溶蛋白組分即為復(fù)性成功的蛋白。Brandford法檢測(cè)可溶組分的蛋白含量。

室溫下,0.3 mL反應(yīng)液中依次加入 0.02 mol/L Tris(pH 8.0),100 μmol/L 輔酶 Q2,0.5 μg SQR,400μmol/L硫化物(使用液氮新鮮處理的水配制)。硫化物加入后開始計(jì)時(shí),記錄3 min內(nèi)輔酶 Q2在OD285nm的降低值[5,6]。SQR 比活值(μmol/(min·mg))=?OD285×A/(B×C×D)。公式中A為反應(yīng)液總體積0.3 mL,B為1 μmol 輔酶Q2的摩爾消光系數(shù)0.00885,C為SQR量0.5 μg,D為反應(yīng)時(shí)間3 min。酶活測(cè)定重復(fù)3次。

1.2.3 透析法濃縮復(fù)性后的單環(huán)刺 6His-SQR蛋白

將稀釋復(fù)性后的蛋白液放入透析袋內(nèi),將聚乙二醇8 000(Polyethylene Glycol 8000,PEG8000)均勻撒在透析袋外,4℃放置。待PEG完全吸水變?yōu)辄S色時(shí),再次在透析袋外均勻?yàn)⑸?PEG,直至 6His-SQR濃縮至濃度為1 g/L。采用1.2.2的方法檢測(cè)濃縮后蛋白的酶活性。

1.2.4 His-pulldown實(shí)驗(yàn)

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,取復(fù)性蛋白(1 g/L)與 Ni2+-NTA 樹脂,于 4℃下緩慢旋轉(zhuǎn)結(jié)合 1 h,將結(jié)合有SQR的樹脂 4℃放置備用; 解剖取單環(huán)刺 體壁組織,用細(xì)胞裂解液(50 mmol/L Tris,0.15 mol/L NaCl,0.1%(m/v)SDS,0.75%(v/v)NP-40,1 mmol/L EGTA,0.5%(m/v) 脫氧膽酸鈉,100 mg/L PMSF)冰上勻漿,4 ℃ 12 000g離心10 min得上清蛋白液,Branford法測(cè)定蛋白濃度后,儲(chǔ)存于冰箱中備用。取單環(huán)刺 體壁組織細(xì)胞裂解液與結(jié)合有單環(huán)刺 6His-SQR的Ni2+-NTA樹脂,于4℃下緩慢旋轉(zhuǎn)結(jié)合1 h,收集過柱流出液,用 Bindbuffer,WashbufferⅠ,Ⅱ,Elution buffer依次洗脫樹脂,并分別收集過柱流出液,所得流出液進(jìn)行12% SDS-PAGE分析。

1.2.5 質(zhì)譜分析

將上述分離的蛋白質(zhì)條帶從凝膠上切割下來,置于1.5 mL Eppendorf管中,用脫色液(50%(v/v)乙腈和 25 mmol/L NH3HCO3溶液,按照1：1混合)在渦旋混合器上震蕩約30 min(37℃),倒掉脫色液,然后重復(fù)上述操作直至藍(lán)色完全褪凈。經(jīng)乙腈脫水后,置于真空干燥機(jī)內(nèi)干燥至膠粒跳起(約 20 min),50μL 0.1g/L的胰蛋白酶液4℃放置15 min吸脹膠塊后,吸出多余胰酶,加入50 μL 25 mmol/ L的NH4HCO3溶液保濕,37℃酶解18 h。離心收集酶解后的上清液,加入10 μL 50%乙腈和2.5%(v/v)三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA)的混合液30℃放置1 h后萃取上清液,重復(fù) 1次,收集合并酶解液; 將合并得到的酶解液體冷凍干燥后,采用毛細(xì)管液相色譜-離子肼質(zhì)譜儀(Thermo Finnigan,San Jose,CA,USA)進(jìn)行質(zhì)譜分析[11,12]。用Bioworks software和SEQUEST軟件采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 單環(huán)刺 6His-SQR體外表達(dá)蛋白的純化

體外重組的 pET28a-SQR/BL21(DE3)菌,在 1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)5 h后獲得表達(dá)產(chǎn)物,經(jīng)Ni2+-NTA柱純化后,得到目的蛋白,分子質(zhì)量約為 50 ku,與預(yù)期的SQR蛋白大小一致(圖1)。

2.2 His-pulldown實(shí)驗(yàn)

通過稀釋法復(fù)性單環(huán)刺 6His-SQR蛋白,并按照 1.2.2的方法測(cè)得該酶的比活值為 5.04 μmol/(min·mg)。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定了使1mLNi2+-NTA樹脂飽和結(jié)合單環(huán)刺 6His-SQR的蛋白量為3mg。圖2中泳道2和3分別為單環(huán)刺 6His-SQR與Ni2+-NTA樹脂結(jié)合前后的電泳結(jié)果,顯示Ni2+-NTA樹脂上已成功結(jié)合6His-SQR蛋白; 通過Bindbuffer平衡樹脂后,使用 pH順次降低的 washbuffer將結(jié)合在Ni2+-NTA樹脂上的非特異性蛋白質(zhì)洗脫下來,最后使用Elution buffer將特異性結(jié)合在Ni2+-NTA樹脂上的SQR及與SQR結(jié)合的蛋白(條帶A和B)一起洗脫下來(圖2泳道9),條帶A和B為單環(huán)刺 組織細(xì)胞裂解液中可能存在的兩個(gè)與 SQR結(jié)合的蛋白質(zhì),它們的分子質(zhì)量約為60 ku和40 ku(圖2)。

圖1 單環(huán)刺 6His-SQR重組蛋白的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of the U.unicinctus SQR recombinant protein

圖2 單環(huán)刺 SQR His-pulldown分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of the U.unicinctus SQR His-pulldown result

2.3 質(zhì)譜分析

His-pulldown實(shí)驗(yàn)所得的兩個(gè)蛋白條帶,經(jīng)質(zhì)譜分析,初步確定其為：細(xì)胞色素 P450和腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(表1)。

表1 與6His-SQR重組蛋白相互作用蛋白的毛細(xì)管液相色譜-離子肼質(zhì)譜分析Tab.1 Ion-trap Mass spectrometer analysis of proteins interacting with the recombinant 6His-SQR protein

3 討論

生物體的大部分生命活動(dòng)發(fā)生在蛋白質(zhì)水平,雖然有一些蛋白質(zhì)可以以單體的形式發(fā)揮作用,但大部分蛋白質(zhì)都是和伴侶分子一起作用或是與其他蛋白質(zhì)形成復(fù)合物來發(fā)揮作用的。因此,研究蛋白質(zhì)相互作用是更好地理解生物的各種生命活動(dòng)的重要手段之一。本實(shí)驗(yàn)選擇適宜大分子量蛋白質(zhì)的六聚組氨酸作為標(biāo)簽,構(gòu)建了單環(huán)刺 SQR六聚組氨酸蛋白,并以此為餌蛋白,采用His-pulldown技術(shù),從單環(huán)刺 體壁組織液中釣取了兩個(gè)與該蛋白相互作用的蛋白質(zhì)。為了消除假陽(yáng)性對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾,我們確定了Ni2+-NTA樹脂與單環(huán)刺 6His-SQR結(jié)合的飽和度,從而有效地避免了實(shí)驗(yàn)的假陽(yáng)性問題。

相對(duì)于整個(gè)蛋白質(zhì)表面而言,蛋白質(zhì)間相互作用位點(diǎn)上含有大量的輸水氨基酸殘基,因此有人認(rèn)為兩個(gè)蛋白質(zhì)的結(jié)合可能來自于輸水性表面區(qū)域的包埋。通常,接觸面中的 Leu、Ile、Val、Phe、Tyr和Met含量豐富[13,14]。本研究通過對(duì)pulldown釣取的兩個(gè)蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析,初步定性它們?yōu)榧?xì)胞色素P450和腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。已知細(xì)胞色素P450主要定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和線粒體膜上[15],并且根據(jù)該蛋白的三維結(jié)構(gòu)分析[16],其分子表面露出的氨基酸殘基含有Phe和Leu等疏水性氨基酸殘基,據(jù)此推測(cè)細(xì)胞色素P450可能與 SQR表面的疏水性氨基酸殘基通過疏水鍵相互結(jié)合。再有,細(xì)胞色素P450在真核生物中具有(1)單加氧酶活性：使烷基碳羥化和芳香環(huán)環(huán)氧化、烷氧基的去烷基等; (2)氧化酶活性：使芳香環(huán)羥基化、苯二酚氧化成醌等; (3)還原酶活性：使偶氮化物還原性裂解為兩分子胺、使硝基還原為氨基、使醌還原成半醌、使鹵代烴脫鹵素等[17]。由此推測(cè)二者的相互作用可能在硫化物的氧化半反應(yīng)中起到電子傳遞的作用。腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族是一組跨膜蛋白,具有 ATP結(jié)合區(qū)域的單向底物轉(zhuǎn)運(yùn)泵,以主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的方式完成多種分子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),該蛋白的核心結(jié)構(gòu)包括核苷酸結(jié)合域和跨膜結(jié)構(gòu)域,這種跨膜結(jié)構(gòu)域是高度疏水的[18,19],因而推測(cè)該蛋白可能通過該結(jié)構(gòu)域與 SQR形成疏水性相互作用,據(jù)此推測(cè)該蛋白在硫化物解毒的過程中可能具有將酶反應(yīng)過程中產(chǎn)生的代謝物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體外的作用。上述推測(cè)需要進(jìn)一步的研究加以證明。

致謝:感謝中國(guó)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的肖鵬老師在質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)中給予的幫助。

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