余敏，王澤華，龔軍麗，馬明星，焦揚，黃惟巍，呂琦，李琳，楊慧，譚德勇

1 云南大學生命科學學院 生物化學與分子生物學實驗室，昆明 650091

2 云南省第一人民醫(yī)院病理科，昆明 650032

3 云南大學單抗研究中心，昆明 650091

ARD1 (Arrest defective 1) 最初在酵母細胞中發(fā)現(xiàn)，是N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶NatA的一個亞基，另一個亞基是Nat1[1-2]。NAT1和ARD1中任何一個亞基的缺失都使 NatA 活性喪失，導致酵母表現(xiàn)出多種異常表型，包括結(jié)合型決定座位 (HML) 的重組抑制，在貧營養(yǎng)狀態(tài)下不能進入G0期，以及染色體不穩(wěn)定[3-5]。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，在哺乳動物細胞中ARD1可以獨立作為乙酰基轉(zhuǎn)移酶發(fā)揮作用[6]。人ARD1 (hARD1) 基因與酵母的 ARD1基因具有高度同源性，已有的研究發(fā)現(xiàn)，hARD1與腫瘤的發(fā)生有關(guān)。通過 RNAi技術(shù)干擾 hARD1基因表達能誘導Hela細胞凋亡[7]。在肺癌細胞中，hARD1可能通過激活?-catenin的活性，從而增強?-catenin與轉(zhuǎn)錄因子TCF4的結(jié)合，增強ClyclinD1的轉(zhuǎn)錄活性，進而促進細胞的增殖[8]。

本研究小組在前期的研究中制備了抗ARD1的多克隆抗體，檢測 hARD1蛋白在不同腫瘤中的表達，發(fā)現(xiàn)hARD1蛋白在乳腺腫瘤、前列腺癌以及肺癌中有較高頻率的表達，其中乳腺腫瘤中的表達頻率最高，提示ARD1可能也參與腫瘤的生長調(diào)控過程，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后相關(guān)[9]。然而，ARD1在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮的作用至今仍未完全闡明，其調(diào)控的靶基因以及與其相互作用的蛋白仍有待進一步發(fā)現(xiàn)。

本研究利用前期工作中已獲得的純化的原核表達重組hARD1蛋白免疫小鼠，篩選并獲得在乳腺癌組織中具有較特異的單克隆抗體細胞株，為hARD1在腫瘤病理診斷的應(yīng)用研究以及探索ARD1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的分子機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 重組hARD1原核表達蛋白的制備

將已構(gòu)建的 pET28b-hARD1表達質(zhì)粒[9]轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3) 感受態(tài)細胞，涂布于含50 mg/L卡那霉素的 LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜。次日挑選菌落，通過PCR檢測獲得陽性克隆。將陽性克隆接種于5 mL含50 mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。次日分別按 1:100的比例接種于400 mL含有50 mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至 OD6000.6~0.8，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，誘導表達6 h，取5 mL培養(yǎng)菌液按常規(guī)方法制備蛋白樣品，選用12%的分離膠進行SDS-PAGE電泳，經(jīng)考馬斯亮藍染色，用凝膠圖像分析系統(tǒng)檢測誘導表達蛋白。

1.2 包涵體的分離和純化

將誘導后的菌液離心，收集菌體，懸浮于PBS磷酸緩沖液中，置于冰上進行超聲破碎。將菌體裂解液離心5 min，保留上清，沉淀用10 mL鹽酸胍 (2 mol/L) 洗滌，10 000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀再用9倍體積緩沖液B (2 mol/L鹽酸胍、0.5% TritonX-100和10 mmol/L EDTA) 洗滌，10 000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀用緩沖液C (8 mol/L尿素，10 mmol/L咪脞，0.1 mol/L磷酸鈉，300 mmol/L NaCl) 溶解后10 000 r/min離心10 min，上清即為分離溶解后的包涵體。將溶解的包涵體蛋白用鎳離子螯合 (His-bind) 層析柱純化，用不同濃度的咪唑緩沖液洗Ni柱，收集洗脫液，獲得純化的hARD1蛋白質(zhì)。將純化蛋白進行 12% SDS-PAGE分析，檢測純化效果并進行蛋白濃度測定，純化蛋白經(jīng)質(zhì)譜鑒定確定為人ARD1蛋白序列。

1.3 hARD1單克隆抗體的制備

純化 hARD1蛋白經(jīng)透析除鹽，50 μg純化的hARD1蛋白 (每只) 與等體積弗氏完全佐劑充分乳化，皮下注射3只6~8周齡的Balb/c雌性小鼠。首次免疫 4周后，用同樣的蛋白量與弗氏不完全佐劑充分乳化，進行第 2次免疫，采用腹腔注射。10 d后，進行第3次腹腔注射。于第3次免疫后的第7天，斷尾采血，用 ELISA法測定血清抗體的效價。于融合前4天，用50 μg溶于PBS中的抗原加強免疫。4 d后，取脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞株Sp2/0-Ag14細胞，按常規(guī)方法融合。用間接 ELISA法篩選，有限稀釋法克隆，并按常規(guī)方法制備鼠單抗。

1.4 單抗類別鑒定

單克隆抗體的重鏈和輕鏈的類型通過ELISA方法鑒定，分別用辣根過氧化物酶 (HRP) 標記的羊抗鼠IgG、IgG-1、IgG-2a、IgG-2b、IgG-3、IgM、IgA以及κ、λ輕鏈型的HRP標記抗體作為二抗替代HRP標記的羊抗鼠IgG進行單抗類別鑒定。

1.5 單克隆抗體的制備及鑒定

利用rProteinA一步法純化雜交瘤細胞腹水樣品，將腹水用固定用緩沖液做倍比稀釋、過濾后直接上柱，再用洗脫液洗脫，并收集抗體峰，洗脫的抗體溶液于PBS中透析后，加0.1% NaN3，分裝，?20℃保存。利用BCA法測定抗體溶液中的總蛋白濃度，SDS-PAGE檢測抗體的純度和分子量。

1.6 乳腺組織樣本的收集和總蛋白的提取

所有腫瘤組織樣品均來自云南省第一人民醫(yī)院的病理科，手術(shù)切除后，組織樣本被放在?80℃保存，樣本的臨床資料從醫(yī)院記錄中獲得。腫瘤組織蛋白的處理如下：取1 g癌組織，切碎，加入1 mL蛋白裂解液 (20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，137 mmol/L NaCl，1 mmol/L MgCl2，10% glycerol，1% Nonidet P-40，100 mg/mL benzamidine，1 mmol/L phenyl-methylsulphonyl-fluoride (PMSF)，100 mmol/L Na3VO4)，置于冰上碾磨，4℃下10 000 r/min離心，取上清，加入等體積的2×上樣緩沖液，沸水浴煮10 min，進行SDS-PAGE和Western blotting分析。

1.7 腫瘤組織 Western blotting檢測和免疫化學分析

將提取的腫瘤組織蛋白進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜。將一抗稀釋400倍，采用ABC (AP) 試劑盒按說明書進行Western blotting分析。腫瘤組織石蠟切片由云南省第一人民醫(yī)院病理科進行鑒定，按病理免疫組織化學檢測要求制片，用SP試劑盒檢測，一抗稀釋 200倍，操作步驟參照試劑盒說明書進行。免疫組織化學結(jié)果由病理學專業(yè)人員按病理學判斷標準進行結(jié)果判斷。

2 結(jié)果

2.1 雜交瘤細胞株的篩選和抗體類型鑒定

在大腸桿菌中表達的全長 hARD1/His·tag融合蛋白 (1~235 aa) 經(jīng)鎳柱純化后進行 SDS-PAGE檢測和質(zhì)譜 (MS) 鑒定。用純化的重組hARD1蛋白免疫3只Balb/c小鼠。免疫反應(yīng)完成后，用梯度稀釋法檢測抗血清的效價。3只免疫小鼠均產(chǎn)生較高效價的抗體 (圖1)，效價達到106。將免疫小鼠殺死，分離脾臟細胞，經(jīng)過細胞融合，用間接ELISA 方法篩選陽性雜交瘤細胞。平板上獲得 8個陽性孔，將陽性細胞用有限稀釋法克隆，獲得 8個穩(wěn)定的hARD1單克隆細胞株 (表1)。將雜交瘤細胞株的培養(yǎng)上清液用間接ELISA法檢測單克隆抗體亞類，發(fā)現(xiàn)所有的雜交瘤細胞株的輕鏈是 κ型的，重鏈有 3種類型：IgG-1、IgG-2a和IgG-2b (見表2)。抗體蛋白利用rProteinA柱進行純化，并進行SDS-PAGE檢測，所有抗體免疫球蛋白組成的分子量見圖2。

圖1 免疫小鼠血清效價測定Fig. 1 Antibody titers of sera from immunized mice.

圖2 8個單克隆抗體重鏈和輕鏈分子量Fig. 2 Heavy and light chain molecular weight of eight monoclonal antibody.

表1 雜交瘤篩選結(jié)果Table 1 Data obtained in hybridomas screening

表2 抗hARD1蛋白的單克隆抗體的類型鑒定Table 2 Identification of subclass of the monoclonal antibodies to hARD1 protein

2.2 單克隆抗體在乳腺癌組織中的靈敏性和特異性篩選

為篩選在乳腺癌組織中特異識別 hARD1蛋白的抗體，從20個乳腺癌組織中選出1個hARD1蛋白表達適中的組織樣本。從雜交瘤細胞中獲得的 8個抗體分別與該組織樣本進行免疫組織化學檢測，根據(jù)免疫組織化學染色的強度篩選，發(fā)現(xiàn) 1號、3號、7號和 8號抗體有較強的反應(yīng)，并被作為候選的特異性抗體 (圖3)。

將選出的候選特異性抗體分別與 33個腫瘤組織樣本，包括腺癌、纖維腺瘤、鱗癌進行免疫組織化學染色檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)源于2G5號細胞株的3號抗體在乳腺腫瘤組織中顯示出較強的顯色特異性，而在其他腫瘤組織中沒有顯色或顯色較弱，其他抗體株的特異性相對3號較差 (表3)。

為了進一步鑒定3號抗體的特異性，進行了乳腺癌腫瘤組織的Western blotting分析，選取了10個乳腺癌組織進行 Western blotting檢測，結(jié)果出現(xiàn)一條26 kDa的單一條帶 (圖4)，說明3號抗體具有較強的特異性。

3 討論

實驗中獲得的 8個抗體株中，雖然每個抗體克隆都能識別hARD1蛋白，但它們存在著不同的特異性和靈敏性。對于同一個腫瘤樣本，1、3、7和 8號抗體對hARD1蛋白有較高的反應(yīng)靈敏性，對于不同的腫瘤樣本，在纖維腺瘤和乳腺導管癌中 3號抗體的顯色信號遠強于其他腫瘤類型，表明了 3號抗體在乳腺癌中的免疫組化染色是特異的。

圖3 8個單克隆抗體株在同一個乳腺腫瘤組織中的顯色信號Fig. 3 Eight monoclonal cell lines expression in a breast cancer tissues. 1?8: different monoclonal cell lines.

表3 不同的抗體株在腫瘤組織中的反應(yīng)Table 3 Reaction of different antibody with tumor tissues

雖然實驗中獲得的抗體株都是識別 ARD1蛋白的抗體，但不同組織中可能存在不同的蛋白，某些蛋白中可能有某些抗原表位與ARD1蛋白相似，因此在不同的組織中其特異性存在差別。本研究中，免疫組織化學檢測結(jié)果顯示，3號抗體在乳腺癌組織中的染色信號最強，而在其他組織中的信號相對較弱，Western blotting檢測在乳腺癌中只有一條特異蛋白條帶，這意味著3號抗體只識別ARD1蛋白。而其他抗體在乳腺癌組織和其他組織中均有染色信號，可能有非特異性的識別。

圖4 3號抗體在乳腺腫瘤組織中的Western blotting檢測Fig. 4 Western blotting analysis in the breast cancer tissues with No. 3 antibody. 1?10: different breast cancer tissues.

乳腺癌是婦女中最常見的腫瘤之一，占所有腫瘤的23%[10]。據(jù)世界范圍內(nèi)的統(tǒng)計，乳腺癌的發(fā)病率每年仍按0.5%的速度增長。盡管乳腺癌的診斷治療水平在不斷提高，但仍有1/4患者死亡[11]。因此，及早診斷對乳腺癌的治療具有重要的意義。生物標志物檢測是腫瘤診斷的一種重要方法。研究表明ARD1的高表達與乳腺癌的發(fā)生有關(guān)，它可以作為乳腺癌臨床診斷的一個生物標志物[9]。在蛋白標志物的病理診斷中，獲得一個好的單克隆抗體是非常重要的。雖然有商業(yè)化的抗ARD1抗體，但它的特性不確定，就難以在病理診斷中應(yīng)用。本研究獲得了一個在乳腺癌組織中特異識別 ARD1蛋白的雜交瘤細胞株，這為進一步將抗 hARD1的單克隆抗體應(yīng)用于乳腺癌的病理診斷奠定了基礎(chǔ)，同時也為進一步研究ARD1在腫瘤發(fā)生中的作用提供了重要的工具。

[1] Whiteway M, Szostak JW. The ARD1 gene of yeast functions in the switch between the mitotic cell cycle and alternative developmental pathways. Cell, 1985, 43: 483?492.

[2] ParkEC, Szostal JW. ARD1 and NAT1 proteins form a complex that has N-terminal acetyl-transferase activity. EMBO J, 2000, 11: 2087?2093.

[3] Mullen JR, Kayne PS, Moerschell RP, et al. Identification and characterization of genes and mutants for an N-terminal acetyltransferase from yeast. EMBO J, 1989, 8(7): 2067?2075.

[4] Whiteway M, Freedman R, Van Arsdell S, et al. The yeast ARD1 gene product is required for repression of cryptic mating-type information at the HML locus. Mol Cell Biol, 1987, 7: 3713?3722.

[5] Lee FJ, Lin LW, Smith JA. N-acetylation is required for normal growth and mating of Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol, 1989, 171: 5795?5802.

[6] Sugiura N, Adams SM, Corriveau RA. An evolutionarily conserved N-terminal acetyltransferase complex associated with neuronal development. J Biol Chem, 2003, 278(41): 40113?40120.

[7] Arnesen T, Gromyko D, Pendino F, et al. Induction of apoptosis in human cells by RNAi-mediated knockdown of hARD1 and NATH, components of the protein N-alphaacetyltransferase complex. Oncogene, 2006, 25(31): 435?4360.

[8] Lim JH, Park JW, Chun YS. Human arrest defective 1 acetylates and activates beta-catenin, promoting lung cancer cell proliferation. Cancer Res, 2006, 66(22): 10677?10682.

[9] Yu M, Huang C, Xiang MJ, et al. hARD1 antiserum preparation and primary immunohistochemical analysis of hARD1 in tumor tissues. Chin J Biotech, 2008, 24(7): 1155?1161.余敏, 黃超, 向明鈞, 等. 抗 ARD1抗血清制備及其初步腫瘤免疫組化分析. 生物工程學報, 2008, 24(7): 1155?1161.

[10] Jemal A, Siegel R, Ward E, et al. Cancer statistics. CA Cancer J Clin, 2006, 56(2): 106?130.

[11] Parkin DM, Bray F, Ferlay J, et al. Global cancer statistics, 2002. CA Cancer J Clin, 2005, 55(2): 74?108.