姜媛媛，劉銘瑤，任桂萍，朱慧萌，李德山

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 生物制藥教研室，哈爾濱 150030

在大腸桿菌中表達(dá)重組蛋白具有使用安全、操作簡(jiǎn)便、周期短且不存在病毒致癌基因污染等優(yōu)點(diǎn)，是重組蛋白藥物研究和生產(chǎn)中使用最廣泛的表達(dá)系統(tǒng)[1-2]。其中關(guān)鍵的問題是選用合適的表達(dá)載體，現(xiàn)已建立的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)有融合表達(dá)、非融合表達(dá)、分泌表達(dá)、帶純化標(biāo)簽的表達(dá)載體等，而融合表達(dá)載體又有pET系列、pTYB及pGEX等。表達(dá)載體的類型雖多，但選擇合適的、滿足人們需求的表達(dá)載體卻很難，如pET系列載體雖然應(yīng)用較廣泛，但對(duì)有些蛋白的表達(dá)卻不是很理想。而其他一些融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)蛋白表達(dá)量雖然很高，但多數(shù)表達(dá)的目的蛋白可溶性較差。這就要求尋找更多的高效穩(wěn)定、可溶性較好的表達(dá)系統(tǒng)以滿足不同類型基因的表達(dá)。

本研究室在表達(dá)鼠源成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)-21的過程中，發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌中難以獲得高效穩(wěn)定的可溶性表達(dá)，其原因可能在于該蛋白在大腸桿菌中較易被蛋白酶降解。曾嘗試了很多表達(dá)載體表達(dá)效果均不理想，如 pET系列表達(dá)載體、pTYB-11等表達(dá)系統(tǒng)對(duì)以上蛋白的表達(dá)量極低或者幾乎不表達(dá)，pGEX6p-1雖然表達(dá)量較高，但可溶性目的蛋白所占比例較小。

SUMO (Small ubiquitin-like modifier-1) 是一種小分子泛素樣修飾蛋白，廣泛存在于各種真核細(xì)胞中，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、RNA轉(zhuǎn)錄、蛋白的核質(zhì)運(yùn)輸以及細(xì)胞周期等多種生理進(jìn)程[3]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)SUMO可以作為重組蛋白表達(dá)的融合標(biāo)簽和分子伴侶，具有抗蛋白酶水解、顯著增加重組蛋白表達(dá)量以及促進(jìn)靶蛋白正確折疊、提高可溶性等功能[4]。小分子泛素樣修飾蛋白 (SUMO) 和泛素 (Ub) 在一級(jí)結(jié)構(gòu)上只有18%的同源性，然而，兩者的三級(jí)結(jié)構(gòu)及其生物學(xué)功能卻十分相似[5]，研究表明其作為重組蛋白的融合標(biāo)簽可以增加蛋白的穩(wěn)定性。

本實(shí)驗(yàn)室自構(gòu)建了SUMO蛋白融合表達(dá)系統(tǒng)，并獲得了鼠源 FGF-21 (mFGF-21) 和多種重組蛋白的高效可溶性表達(dá)。該融合表達(dá)系統(tǒng)可根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)需要設(shè)計(jì)引物，采用兩種不同切割方式來獲得所需的成熟目的蛋白。一種方式是利用SUMO蛋白酶I切割，經(jīng)SUMO蛋白酶I切割表達(dá)的融合蛋白可以獲得純度較高的成熟蛋白且不殘留任何氨基酸殘基，而且SUMO蛋白酶I的識(shí)別序列為SUMO蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。但目前SUMO蛋白酶I在國(guó)內(nèi)購(gòu)買比較困難，而從國(guó)外郵購(gòu)價(jià)格比較昂貴 (1000 U約4000元人民幣)。因此，本實(shí)驗(yàn)又設(shè)計(jì)了另外一種切割方式，即在SUMO融合表達(dá)系統(tǒng)中位于SUMO蛋白酶切位點(diǎn)之后引入了羥胺切割位點(diǎn)，利用化學(xué)切割方法獲得成熟目的蛋白，這樣可以大大降低蛋白純化的成本，且切割后只殘留一個(gè)小分子甘氨酸對(duì)蛋白活性并無影響?，F(xiàn)以mFGF-21為例，介紹SUMO蛋白融合表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建及應(yīng)用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和受體菌

質(zhì)粒pMD18-T-mFGF-21 (pMD18-T購(gòu)自TaKaRa公司)、pMD18-T-His-SUMO (pMD18-T購(gòu)自TaKaRa公司)、受體菌E. coli DH5α菌株、BL21菌株 (含DE3)、Rosetta菌株 (含 DE3)、pET-30a(+)載體由本實(shí)驗(yàn)室提供；小鼠成纖維細(xì)胞系3T3-L1購(gòu)自ATCC。

1.1.2 酶和主要生化試劑

Bsa ?、BamH ?購(gòu)自New England BioLabs公司；pMD18-T、dNTPs、其他限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購(gòu)自TaKaRa公司；SUMO蛋白酶I購(gòu)自Life Sensors公司；IPTG (異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)、溶菌酶、卡那霉素購(gòu)自TaKaRa公司；DNA回收試劑盒購(gòu)自上海華舜生物工程有限公司；Ni-NTA瓊脂糖顆粒購(gòu)自QIAGEN公司；高糖DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自 Invitrogen Corporation；新生牛血清 (NCS)、優(yōu)質(zhì)胎牛血清 (FBS) 購(gòu)自 Invitrogen Corporation；dexamethasone (Dex)、isobutyl methylxanthine (IBMX)、human recombinant insulin購(gòu)自Sigma公司；葡萄糖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自四川邁克科技有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

依據(jù)軟件分析得到的成熟mFGF-21 cDNA序列設(shè)計(jì)引物P1、P2、P3，將成熟mFGF-21和HisSUMO基因片段與pET-30a(+) 載體連接。引物P1中含有Bsa I和Asc I酶切位點(diǎn)，并且在Asc I酶切位點(diǎn)之后加入羥胺切割位點(diǎn)，P2是從TAA開始3′端編碼區(qū)內(nèi)的序列，其中設(shè)計(jì)QQQQQC有BamH I酶切位點(diǎn)，使得 PCR產(chǎn)物經(jīng)過酶切后的粘性末端可以與pET-30a(+) 載體相連。P3中含有Bsa I酶切位點(diǎn)，在此位點(diǎn)之后為SUMO蛋白酶I切割位點(diǎn)。構(gòu)建后的載體根據(jù)需要分別用于表達(dá)兩種融合蛋白：一種表達(dá)可用于SUMO蛋白酶I切割的融合蛋白 (以P3、P2為引物)；另一種表達(dá)帶有羥胺切割位點(diǎn)的融合蛋白 (以 P1、P2為引物)。另外，設(shè)計(jì)引物 P4、P5，P4含有Nde I酶切位點(diǎn)，P5含有Xho I酶切位點(diǎn)，P4、P5為引物得到的 PCR產(chǎn)物雙酶切后連接至pET-30a(+) 表達(dá)載體。引物均由Invitrogen公司合成。

1.2.2 融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建

pMD18-T-His-SUMO質(zhì)粒和 pET-30a(+) 分別用Nde I和BamH ?雙酶切，回收酶切片段；將以上兩種回收產(chǎn)物利用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，提取重組質(zhì)粒，酶切鑒定陽(yáng)性克隆即可獲得 HisSUMO Express表達(dá)載體。

以質(zhì)粒 pMD18-T-mFGF-21[6]為模板，分別以P1、P2 (獲得的融合蛋白用于羥胺切割) 和P3、P2 (獲得的融合蛋白用于 SUMO蛋白酶 I切割) 為引物，用rTaq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50 μL。擴(kuò)增產(chǎn)物分別用Bsa I和BamH ?雙酶切，回收酶切片段；將HisSUMO Express表達(dá)載體分別用Bsa I和BamH ?雙酶切，回收酶切載體片段，將酶切回收后的兩種 mFGF-21 PCR產(chǎn)物分別與 HisSUMO Express載體回收產(chǎn)物利用 T4 DNA連接酶進(jìn)行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，分別提取兩種重組質(zhì)粒，Xba I和BamH ?雙酶切鑒定陽(yáng)性克隆，并將兩種陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。

pET30a(+) 載體和質(zhì)粒 pMD18-T-mFGF-21分別用Nde I、Xho I雙酶切，回收酶切片段，制備帶有相匹配粘性末端的線性DNA。將膠回收后的目的片段 mFGF-21與原核表達(dá)載體 pET30a(+) 用 T4 DNA連接酶進(jìn)行連接。連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至 BL21感受態(tài)菌中，提取重組質(zhì)粒后分別用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和Xho I進(jìn)行雙酶切鑒定和重組質(zhì)粒的PCR鑒定。陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為pET-30a(+)-mFGF-21。

1.2.3 目的基因在大腸桿菌中的表達(dá)及融合蛋白的純化

將含有正確序列的重組質(zhì)粒 HisSUMO ExpressmFGF-21 (無羥胺切割位點(diǎn))、重組質(zhì)粒 HisSUMO Economic-mFGF-21 (含有羥胺切割位點(diǎn)) 和重組質(zhì)粒 pET-30a(+)-mFGF-21分別轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株Rosetta。轉(zhuǎn)化后的單菌落分別接種至5 mL LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)10 h，以1:100接種于500 mL含卡那霉素 (50 mg/mL) 的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)2 h，A600=0.3~0.6時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.25 mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo) 3 h后分別取少量菌體及未誘導(dǎo)的對(duì)照樣品進(jìn)行12% SDS-PAGE[7]電泳，并確定表達(dá)的目的蛋白占菌體總蛋白的百分比。其余收獲的菌體進(jìn)行超聲破碎后離心[8]，分別取上清和沉淀進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳分析。菌體經(jīng)超聲破碎后離心，上清經(jīng)Ni-NTA柱親和層析，用雜蛋白洗脫液 (30 mmol/L咪唑，300 mmol/L NaCl，50 mmol/L NaH2PO4，pH 8.0)洗去雜蛋白后，用洗脫液 (250 mmol/L咪唑，300 mmol/L NaCl，50 mmol/L NaH2PO4，pH 8.0) 洗脫融合蛋白，收集洗脫的第一、二峰。分別取兩種融合蛋白各5 μL進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.4 融合蛋白的切割

將用于羥胺切割的融合蛋白 (濃度為1 mg/mL)濃縮5倍，分別以體積比為1:1、1:2、1:3、1:4加入2×羥胺切割液[9](2.0 mol/L鹽酸羥胺，0.2 mol/L Ches，在45℃條件下調(diào)節(jié)pH值至9.5)，45℃反應(yīng)4 h后將各體系加入PBS至蛋白濃縮前體積，取樣進(jìn)行15% SDS-PAGE檢測(cè)，分析最佳羥胺切割液濃度。同時(shí)將方法1.2.3收集的SUMO-mFGF-21融合蛋白 (濃度為1 mg/mL) 經(jīng)PBS透析24 h后，以每10 μg融合蛋白: 1U SUMO蛋白酶 I的比例加入SUMO蛋白酶I[10]，DTT終濃度為2 mmol/L，4℃切割過夜，并取樣進(jìn)行15% SDS-PAGE檢測(cè)。

1.2.5 成熟蛋白的純化

羥胺切割后產(chǎn)物經(jīng) PBS緩沖液透析以除去切割液，再經(jīng)Ni-NTA顆粒親和層析，收集唯一的洗脫峰，即為mFGF-21成熟目的蛋白，用洗脫液 (250 mmol/L咪唑，300 mmol/L NaCl，50 mmol/L NaH2PO4，pH 8.0)洗脫 Ni-NTA顆粒結(jié)合的小泛素相關(guān)修飾物蛋白，15% SDS-PAGE電泳檢測(cè)。將SUMO蛋白酶切割后的產(chǎn)物也通過Ni-NTA顆粒親和層析進(jìn)行純化，具體純化方法同上。經(jīng) HPLC檢測(cè)蛋白純度，純度大于95%的目的蛋白用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 鼠源 FGF-21的免疫活性檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)一抗為實(shí)驗(yàn)室自制兔抗人FGF-21抗體，HRP標(biāo)記的二抗為鼠抗兔抗體，購(gòu)自 R&D公司。將上述步驟1.2.5中所得的mFGF-21成熟蛋白、小泛素相關(guān)修飾物及 BSA對(duì)照樣品進(jìn)行 Western blotting分析。首先將樣品進(jìn)行15% SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，用5%的脫脂奶粉封閉，然后將膜用相應(yīng)一抗4℃孵育過夜約12 h，二抗室溫孵育2 h后，洗滌，加入化學(xué)發(fā)光底物SuperSignal檢測(cè)試劑 (PIERCE)，暗室X光片暗匣曝光、顯影。

1.2.7 3T3-L1脂肪細(xì)胞的分化

3T3-L1小鼠成纖維細(xì)胞以 2.5×104的密度接種細(xì)胞于 12孔板中，在含 10%新生小牛血清 NCS (Invitrogen Corporation) 的高糖DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至接觸抑制時(shí)，用含10%胎牛血清FBS、0.25 μmol/L地塞米松(Dex)、0.5 mmol/L 異丁基甲基黃嘌呤(IBMX)、5 μg/mL重組人胰島素的DMEM培養(yǎng)基分化48 h后，撤去Dex、IBMX，用重組人胰島素再繼續(xù)分化48 h，此后用含10% FBS的DMEM的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)10 d，每?jī)商鞊Q一次液直到細(xì)胞完成分化，90%以上的細(xì)胞表現(xiàn)出脂肪細(xì)胞特征。

1.2.8 FGF-21對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞糖代謝作用的測(cè)定

將分化成熟的 3T3-L1脂肪細(xì)胞饑餓處理 12 h后，用不同濃度的成熟mFGF-21蛋白刺激細(xì)胞，溫育24 h后，取上清培養(yǎng)基利用葡萄糖氧化酶法測(cè)定培養(yǎng)基中的葡萄糖含量[11]。同時(shí)設(shè)未經(jīng)mFGF-21處理的細(xì)胞對(duì)照組，以未接種細(xì)胞空白復(fù)孔的糖含量均值相減，算出各孔細(xì)胞的葡萄糖消耗量。

每個(gè)濃度至少設(shè) 3個(gè)獨(dú)立的重復(fù)組，并運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。數(shù)據(jù)均以±s表示，兩組間計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定

以質(zhì)粒pMD18-T-mFGF-21為模板，分別以P1、P2和P3、P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物為600 bp左右，與預(yù)期大小相符 (圖1)。

2.2 融合表達(dá)載體的構(gòu)建

將膠回收的mFGF-21基因序列和帶有羥胺切割位點(diǎn)的 mFGF-21序列分別與線性化的 HisSUMO Express表達(dá)載體連接。重組表達(dá)載體經(jīng) Xba I和BamH ?雙酶切鑒定后，分別獲得產(chǎn)物為 912 bp (SUMO序列/目的序列) 和926 bp (SUMO序列/羥胺切割位點(diǎn)/目的序列) 的清晰條帶，與預(yù)期一致 (圖2)。 DNA測(cè)序結(jié)果表明該重組載體中HisSUMO序列以正確的讀碼框插入至 T7啟動(dòng)子下游，目的片段mFGF-21和帶有羥胺切割位點(diǎn)的mFGF-21序列均以正確的讀碼框插入至 SUMO序列下游。HisSUMO Express和HisSUMO Economic表達(dá)載體的構(gòu)建如圖3所示。

圖1 鼠源FGF-21基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplication of the mouse FGF-21. 1: PCR products with the primer P1 and P2; 2: PCR products with the primer P3 and P2; M: 100 bp DNA ladder.

圖2 重組表達(dá)質(zhì)粒 HisSUMO Express-mFGF-21和HisSUMO Economic-mFGF-21的酶切鑒定Fig. 2 Restriction enzyme identification of the recombinant plasmid HisSUMO Express-mFGF-21 and HisSUMO Economic-mFGF-21. 1: HisSUMO Express-mFGF-21/Xba I+BamH ? (without hydroxylamine cleavage site); 2: HisSUMO Express-mFGF-21 (without hydroxylamine cleavage site); 3: DNA marker DL15000; 4: recombinant plasmid HisSUMO Economic-mFGF-21/Xba I+BamH ? (containing hydroxylamine cleavage site); 5: recombinant plasmid HisSUMO EconomicmFGF-21 (containing hydroxylamine cleavage site).

取陽(yáng)性重組質(zhì)粒 pET-30a-mFGF-21，分別用限制性內(nèi)切酶Nde I、Xho I進(jìn)行雙酶切鑒定和重組質(zhì)粒的PCR鑒定。用限制性內(nèi)切酶Nde I、Xho I進(jìn)行雙酶切，獲得兩個(gè)片段，分別為約 5300 bp的pET-30a(+) 載體片段和約550 bp的mFGF-21目的基因片段。以P4和P5為引物、pET-30a-mFGF-21為模板進(jìn)行PCR鑒定，在約550 bp處有一條目的帶，與預(yù)期插入片段大小 (561 bp) 相符 (圖4)，確認(rèn)陽(yáng)性重組質(zhì)粒pET-30a-mFGF-21構(gòu)建成功 (圖5)。

圖3 表達(dá)載體HisSUMO Express和HisSUMO Economic構(gòu)建圖譜Fig. 3 Constructinon of HisSUMO Expression and HisSUMO Economic.

2.3 SUMO-mFGF-21融合蛋白的表達(dá)及純化

將含有重組質(zhì)粒 HisSUMO Express-mFGF-21 (無羥胺切割位點(diǎn))、重組質(zhì)粒 HisSUMO EconomicmFGF-21 (含有羥胺切割位點(diǎn))、pET-30a(+) -mFGF-21的 Rosetta菌株接種后誘導(dǎo)，加入 IPTG誘導(dǎo)3 h后取樣進(jìn)行電泳分析，結(jié)果顯示pET-30a(+)系統(tǒng)未能表達(dá)mFGF-21，而融合蛋白在SUMO體系中表達(dá)量較高，且均為可溶性蛋白 (圖 6)，純化后的SUMO-mFGF-21融合蛋白上樣量為5 μL (濃度約為1 mg/mL)，其分子量約為44 000 Da (圖7)。融合蛋白經(jīng)蛋白薄層掃描計(jì)算融合蛋白的表達(dá)量，如圖8所示，可見經(jīng)HisSUMO Express系統(tǒng)表達(dá)mFGF-21重組蛋白占宿主細(xì)胞中總蛋白質(zhì)的 40%，而HisSUMO Economic系統(tǒng)表達(dá)的mFGF-21重組蛋白占宿主細(xì)胞中總蛋白質(zhì)的43.17%。

圖4 重組質(zhì)粒pET-30a-mFGF-21的酶切鑒定Fig. 4 Identification of recombinant plasmid pET-30a-mFGF-21 by enzyme digestion. 1: DNA marker DL2000; 2: 1 kb Plus DNA ladder; 3: recombinant plasmid pET-30a-mFGF-21 digested with Nde I and Xho I.

圖5 重組質(zhì)粒pET-30a-mFGF-21的PCR鑒定Fig. 5 Identification of the positive plasmid of pET-30a-mFGF-21 by PCR. 1: 100 bp DNA marker; 2: PCR products with the primer P4 and P5.

2.4 融合蛋白的切割情況分析

融合蛋白經(jīng)不同濃度羥胺切割液切割，并與蛋白酶切割作對(duì)比。蛋白 (1 mg/mL) 與羥胺切割液體積比為1:4時(shí)蛋白切割效率較高，結(jié)果如圖9所示。而蛋白酶價(jià)格昂貴，鹽酸羥胺則比較經(jīng)濟(jì)，可以通過提高羥胺濃度來提高切割效果。

圖6 HisSUMO Express和HisSUMO Economic表達(dá)載體介導(dǎo)的鼠源FGF-21蛋白的表達(dá)Fig. 6 Expression of mFGF-21 in E. coli mediated by HisSUMO Express and HisSUMO Economic. 1: supernatant of Rosetta cells harboring HisSUMO Express-mFGF-21 (without hydroxylamine cleavage site) 3 hours after IPTG induction; 2: precipitate of Rosetta cells harboring HisSUMO ExpressmFGF-21 without IPTG induction (without hydroxylamine cleavage site); 3: supernatant of Rosetta cells harboring HisSUMO Economic-mFGF-21 3 hours after IPTG induction (containing hydroxylamine cleavage site); 4: precipitate of Rosetta cells Harboring HisSUMO Economic-mFGF-21 without IPTG induction (containing hydroxylamine cleavage site); 5: protein molecular mass marker; 6: Rosetta cells harboring HisSUMO Economic-mFGF-21 expression vector (containing hydroxylamine cleavage site) without IPTG induction; 7: lysates of Rosetta cells harboring recombinate pET-30a(+)-mFGF-21 expression vector 3 hours after IPTG induction; 8: lysates of Rosetta cells harboring recombinate pET-30a(+)-mFGF-21 expression vector without IPTG induction.

圖7 SUMO-mFGF-21的純化Fig. 7 Purification of SUMO-mFGF-21. 1: SUMO-mFGF-21 protein (without hydroxylamine cleavage site); 2: protein marker; 3: SUMO-mFGF-21 protein (containing hydroxylamine cleavage site).

圖8 誘導(dǎo)菌總蛋白、His-SUMO-FGF-21重組蛋白的薄層掃描圖Fig. 8 Laminal scanning figure of protein content of the positive bacterium.

圖9 SUMO-mFGF-21融合蛋白經(jīng)羥胺切割后的SDS-PAGE電泳分析Fig. 9 SDS-PAGE analysis of SUMO-mFGF-21 fusion protein after cleaved by hydroxylamine. 1: SUMO-mFGF-21 protein before cleavage (without hydroxylamine cleavage site); 2: SUMO-mFGF-21 protein before cleavage (containing hydroxylamine cleavage site); 3: protein marker; 4: the products of SUMO-mFGF-21 fusion protein after cleaved by SUMO protease I (without hydroxylamine cleavage site); 5: the products cleaved by hydroxylamine with the radio of the fusion protein and hydroxylamine solution is 1:4; 6: the products cleaved by hydroxylamine with the radio of the fusion protein and hydroxylamine solution is 1:3; 7: the products cleaved by hydroxylamine with the radio of the fusion protein and hydroxylamine solution is 1:2; 8: the products cleaved by hydroxylamine with the radio of the fusion protein and hydroxylamine solution is 1:1.

2.5 成熟蛋白純化產(chǎn)物

將 SUMO融合蛋白經(jīng)羥胺切割后的產(chǎn)物置于PBS緩沖液中透析24 h，再經(jīng)Ni-NTA顆粒親和層析，收集唯一的洗脫峰，即為mFGF-21成熟蛋白，15% SDS-PAGE電泳檢測(cè) (圖10)。純化的mFGF-21成熟蛋白回收量約為54 mg/L，成熟蛋白回收率約為6%。

2.6 mFGF-21的免疫活性檢測(cè)分析

通過軟件比對(duì)鼠源FGF-21與人源FGF-21的氨基酸序列可知兩者的同源性達(dá)80.66%，表明兔抗人全長(zhǎng)FGF-21抗體可與mFGF-21發(fā)生很強(qiáng)的交叉反應(yīng)，因此可用兔抗人FGF-21抗體作為1抗檢測(cè)mFGF-21。Western blotting試驗(yàn)中1號(hào)泳道加入1 μg BSA作為陰性對(duì)照，2號(hào)泳道加入1 μg SUMO-mFGF-21融合蛋白 (含羥胺切割位點(diǎn))，3號(hào)泳道加入 10 ng純化的mFGF-21蛋白作為待檢物。Western blotting結(jié)果分析表明，2、3號(hào)泳道的蛋白與抗人FGF-21抗體發(fā)生反應(yīng)，該條帶分別為 SUMO-mFGF-21融合蛋白和mFGF-21。證明抗人FGF-21抗體與鼠FGF-21反應(yīng)的特異性，且所純化的蛋白為成熟 mFGF-21，如圖11所示。

2.7 3T3-L1脂肪細(xì)胞的分化

圖10 SDS-PAGE電泳分析純化的成熟鼠源FGF-21Fig. 10 SDS-PAGE analysis of purified mouse FGF-21. 1: protein marker; 2: purified mouse FGF-21; 3: the products of SUMO-mFGF-21 fusion protein after cleaved by hydroxylamine.

圖11 鼠源FGF-21的Western blotting分析Fig. 11 Characterization of the mouse FGF-21 by Western blotting. 1: BSA; 2: SUMO-mouse FGF-21; 3: mouse FGF-21.

小鼠成纖維細(xì)胞3T3-L1形成單層后，用脂肪細(xì)胞分化液I (5 mg/L 重組人胰島素，0.25 μmol/L地塞米松，0.5 mmol/L IBMX，10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基) 誘導(dǎo)分化48 h，再用脂肪細(xì)胞分化液II (5 mg/L重組人胰島素，10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基) 繼續(xù)誘導(dǎo)48 h，此后用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)維持，每?jī)商鞊Q一次液，分化14 d后，分化率可達(dá)90%以上的細(xì)胞用于葡萄糖吸收試驗(yàn)，如圖12所示，左圖為未分化的 3T3-L1前脂肪細(xì)胞，細(xì)胞呈成纖維狀，右圖為分化成熟的脂肪細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)有大量的脂滴積聚，表現(xiàn)出明顯的脂肪細(xì)胞特征。

2.8 鼠FGF-21對(duì)脂肪細(xì)胞中葡萄糖吸收的影響

用培養(yǎng)基稀釋分別經(jīng)羥胺和SUMO蛋白酶I切割后的成熟mFGF-21，使其終濃度分別為0.1、1、10、100、1000 nmol/L。用以上濃度的mFGF-21處理小鼠3T3-L1脂肪細(xì)胞，24 h后取上清培養(yǎng)基經(jīng)微量化的GOD-POD法檢測(cè)培養(yǎng)基中葡萄糖含量，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取利用顯著增加，與未經(jīng)任何處理的對(duì)照組相比，殘存在培養(yǎng)基中的葡萄糖含量明顯減少 (兩樣本比較的t檢驗(yàn)，P<0.05差異顯著，P<0.001差異極顯著)。未經(jīng)處理的空白對(duì)照組中，小鼠3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗率只有44.61%，而經(jīng)mFGF-21 (SUMO蛋白酶I切割) 作用的脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗率顯著增加，在濃度為 0.1 nmol/L時(shí)可達(dá)到 50.78%，并且隨著mFGF-21濃度的增加，細(xì)胞葡萄糖消耗率顯著增加，呈劑量依賴關(guān)系，在濃度為 1000 nmol/L時(shí)高達(dá)80.66%，比未處理空白對(duì)照增加近40%，而羥胺切割后的mFGF-21處理3T3-L1脂肪細(xì)胞也能達(dá)到相同的結(jié)果，處理后的細(xì)胞葡萄糖消耗率顯著增加，并呈劑量依賴性關(guān)系，如圖13所示。可見，兩種切割方式獲得的mFGF-21均具有促進(jìn)脂肪細(xì)胞消耗葡萄糖的生物學(xué)功能。

圖12 3T3-L1前體脂肪細(xì)胞分化圖 (400×)Fig. 12 Differentiation of 3T3-L1 pre-adipocytes (400×).

圖13 鼠源FGF-21作用后3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖的消耗曲線Fig. 13 Glucose uptake of 3T3-L1 adipocytes treated with mouse FGF-21. The values (± SE) shown are the average of at least 3 independent measurements. *P<0.05; **P<0.001 compared with no stimulated control.

3 討論

本實(shí)驗(yàn)室成功構(gòu)建了 HisSUMO Express和HisSUMO Economic 兩個(gè)表達(dá)系統(tǒng)，并分別利用這兩種系統(tǒng)成功地表達(dá)和純化了 mFGF-21，利用SUMO蛋白酶I或羥胺切割液切割均能獲得具有活性的目的蛋白。由于SUMO蛋白酶I和SUMO蛋白引入了多聚組氨酸，可以與 Ni-NTA瓊脂糖顆粒結(jié)合，因此可以利用 Ni-NTA親和層析分離出有活性的成熟蛋白。

先前的大量實(shí)驗(yàn)表明，F(xiàn)GF-21在大腸桿菌中難以獲得高效可溶性表達(dá)，最初筆者使用pET系列和pTYB表達(dá)系統(tǒng)，但目的蛋白表達(dá)量極低。而通過分子伴侶進(jìn)行融合表達(dá) (如pGEX表達(dá)系統(tǒng))，盡管可以提高蛋白的表達(dá)量以及成熟蛋白的收獲率，但多數(shù)融合蛋白是以包涵體的形式表達(dá)，復(fù)性比較困難，在此過程中也摸索了很多誘導(dǎo)條件，但表達(dá)效果均不理想 (數(shù)據(jù)未顯示)。

SUMO近年來被發(fā)現(xiàn)可用作分子伴侶來增加外源蛋白的穩(wěn)定性和可溶性，其作用機(jī)理可能是SUMO蛋白作為一個(gè)高度疏水的核心為目的蛋白的折疊提供成核位點(diǎn)[8-10]，促進(jìn)蛋白間的相互作用并使其正確折疊，最終增強(qiáng)了融合蛋白的可溶性[10]。誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)于融合蛋白SUMO-mFGF-21的表達(dá)量影響較大，誘導(dǎo)3 h、4 h、5 h時(shí)蛋白表達(dá)量較高，當(dāng)誘導(dǎo)過夜時(shí)融合蛋白含量較少，推測(cè)可能被菌體內(nèi)的蛋白酶所降解。為避免純化時(shí)雜蛋白含量較高，本實(shí)驗(yàn)選擇了誘導(dǎo)2 h，制備獲得了純度較高的融合蛋白。

本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的融合表達(dá)載體可根據(jù)需要選擇融合蛋白切割方式，該融合蛋白在利用SUMO蛋白酶I進(jìn)行切割時(shí)可保證無氨基酸殘留，切割后，成熟的mFGF-21有明顯促進(jìn)3T3-L1脂肪細(xì)胞吸收葡萄糖的活性。但SUMO蛋白酶I價(jià)格比較昂貴，并且在國(guó)內(nèi)購(gòu)買比較困難。在此基礎(chǔ)上我們又構(gòu)建了比較經(jīng)濟(jì)實(shí)用的、用鹽酸羥胺來切割融合蛋白的表達(dá)體系，據(jù)資料顯示羥胺切割位點(diǎn)在蛋白中存在較少，經(jīng)軟件分析成熟mFGF-21氨基酸序列內(nèi)無羥胺切割位點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建載體時(shí)在SUMO和mFGF-21之間加入羥胺切割位點(diǎn)，且通過摸索切割液濃度可以選擇最適合的比例切割，以達(dá)到較高的切割效率。羥胺切割后只在氨基端殘留一個(gè)小分子甘氨酸，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明并不影響蛋白活性。羥胺切割純化的成熟mFGF-21具有促進(jìn)脂肪細(xì)胞吸收葡萄糖的作用，并呈劑量依賴性。此外，除了mFGF-21以外，本實(shí)驗(yàn)室還利用HisSUMO Express和HisSUMO Economic表達(dá)系統(tǒng)成功地表達(dá)了人源FGF-21、人源IL-1β[12-14]、IL-17、TNFα等蛋白，所得蛋白均為可溶性，約占宿主細(xì)胞總蛋白的40%左右，并且獲得的蛋白均具有生物學(xué)活性。由此可見，本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的2個(gè)表達(dá)系統(tǒng)均可以高效表達(dá)可溶性目的蛋白，既可用SUMO蛋白酶I切割，又可以通過比較經(jīng)濟(jì)的化學(xué)切割方法純化成熟蛋白，而且化學(xué)切割方法經(jīng)濟(jì)可行比較適合我國(guó)國(guó)情，該載體的構(gòu)建是蛋白表達(dá)純化領(lǐng)域中表達(dá)載體的一個(gè)重要改進(jìn)，為生物技術(shù)領(lǐng)域中重組蛋白的研究和應(yīng)用提供了有用的工具。

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