覃紹敏，白安斌，吳健敏，廖文軍，袁書智，華俊，關(guān)忠誼

1 廣西獸醫(yī)研究所，南寧 530001

2 惠朋動物藥業(yè)有限責(zé)任公司，南寧 530001

豬瘟 (Classical swine fever，CSF) 是由豬瘟病毒(Classical swine fever，CSFV) 引起的危害養(yǎng)豬業(yè)最嚴(yán)重的傳染病，是我國計劃要消滅的四大動物傳染病之一。在豬瘟綜合防制措施中，定期抗體監(jiān)測是了解豬群免疫狀況和評價疫苗免疫效果的根本保證。目前臨床上常用的豬瘟抗體檢測方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗 (ELISA) 和間接血凝試驗 (IHA)，然而，這兩種方法都有其不足之處。ELISA方法需要輔助儀器，且成本較高，耗時相對較長，限制了該方法在基層的進(jìn)一步普及；IHA 雖然不需要特殊的輔助儀器，且簡便、快捷、易操作，但此方法穩(wěn)定性不高，不同批次生產(chǎn)的豬瘟病毒抗原在檢測同一份血清樣品時，獲得的結(jié)果往往差異較大，很難準(zhǔn)確反映豬群抗體水平的高低。因此，有必要建立一種快速、簡便、準(zhǔn)確、穩(wěn)定的豬瘟抗體檢測方法應(yīng)用于臨床。

近年來，以紅細(xì)胞作為指示細(xì)胞的一類快速檢測方法——紅細(xì)胞凝集試驗發(fā)展迅速，有望應(yīng)用于快速檢測領(lǐng)域[1-7]。該方法簡便、快速、敏感、特異，又不需要任何特殊儀器，它使檢測工作像測血型一樣簡便，尤其適合于基層和現(xiàn)場使用。其基本原理是：以紅細(xì)胞作為指示細(xì)胞，利用基因工程方法構(gòu)建一種重組雙功能融合蛋白 (目標(biāo)肽抗原或抗體與紅細(xì)胞非凝集型抗體聯(lián)結(jié)而形成的肽抗原-抗體或抗體-抗體結(jié)合物)，該融合蛋白既能與紅細(xì)胞結(jié)合又能與被檢抗體/抗原結(jié)合，通過樣品中被檢抗體/抗原的橋聯(lián)作用，使指示紅細(xì)胞發(fā)生凝集，根據(jù)指示紅細(xì)胞的凝集現(xiàn)象達(dá)到快速檢測的目的。

抗人紅細(xì)胞抗體是一類針對人紅細(xì)胞表面各種抗原的單克隆抗體，其中 IgG 類抗體因其在鹽水介質(zhì)中能與紅細(xì)胞結(jié)合但不使紅細(xì)胞凝集，被稱為抗人紅細(xì)胞非凝集型單抗。近年來的研究證實，該類單抗無論是在疾病診斷還是臨床治療方面，都具有很大的潛力。將抗人紅細(xì)胞單抗改造成重組的單鏈抗體，會進(jìn)一步拓展該類單抗的應(yīng)用范圍。

紅細(xì)胞 H血型抗原是除稀有的孟買 (Bombay)型紅細(xì)胞外，分布在所有人紅細(xì)胞表面的共有抗原。本研究在抗人紅細(xì)胞 H抗原單鏈抗體 (2E8ScFv)[8]的基礎(chǔ)上，通過重疊延伸 (SOE) PCR方法，將經(jīng)過定點突變的CSFV E2蛋白主要抗原編碼區(qū) (mE2)[9]與其融合，成功構(gòu)建了2E8mE2融合蛋白，并在大腸桿菌中獲得了表達(dá)。對融合蛋白進(jìn)行純化和復(fù)性，通過人紅細(xì)胞凝集試驗檢測，證實該融合蛋白既具有凝集性 (與人紅細(xì)胞結(jié)合) 又具有免疫反應(yīng)性(與CSFV抗體反應(yīng))，是一種雙功能的融合蛋白，為下一步建立豬瘟抗體快速檢測方法奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 重組質(zhì)粒、載體、菌株和血清

重組質(zhì)粒 pMD-2E8ScFv (含有抗人紅細(xì)胞 H抗原單鏈抗體基因)[8]由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所章金剛研究員惠贈；重組質(zhì)粒 pETmE2 (含有CSFV E2蛋白主要抗原編碼區(qū)基因mE2)[9]和CSFV高免血清均由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所涂長春研究員惠贈；原核表達(dá)載體pET-DsbA、表達(dá)菌株BL21(DE3)PlysS由本實驗室保存；20份CSFV陽性血清、20份CSFV陰性血清、豬繁殖與呼吸綜合征病毒PRRSV陽性血清、豬流感病毒SIV陽性血清、豬圓環(huán)病毒2型PCV2陽性血清、豬偽狂犬病病毒PRV陽性血清和豬細(xì)小病毒PPV陽性血清均由本實驗室保存。

1.2 主要試劑

T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶BamH I和Nhe I、Taq DNA聚合酶均為TaKaRa公司產(chǎn)品；Wizard PCR產(chǎn)物純化試劑盒、IPTG均為Promega公司產(chǎn)品；鼠源抗6 × His單克隆抗體為Merck公司產(chǎn)品；辣根過氧化物酶 (HRP) 標(biāo)記羊抗鼠IgG為進(jìn)口分裝產(chǎn)品；HRP標(biāo)記羊抗豬IgG為Santa公司產(chǎn)品；Ni-NTA蛋白純化樹脂為Qiagen公司產(chǎn)品；氧化型谷胱甘肽和還原型谷胱甘肽均為 Sigma公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 重組PCR引物設(shè)計

根據(jù)重疊延伸PCR的原理和mE2與2E8ScFv基因序列，設(shè)計4條重組PCR引物 (表1)。其中引物2E8ScFv-F/2E8ScFv-R用于擴增合成 2E8ScFv基因，引物 mE2-F/mE2-R用于擴增合成 mE2 基因。2E8ScFv 3′末端15個堿基和mE2 5′端15個堿基為互補序列 (陰影部分) 用于基因的拼接，拼接順序為2E8ScFv-mE2。2E8ScFv-F和mE2-R中的下劃線部分為便于克隆分別引入的BamH I、Nhe I酶切位點。引物均由北京博邁德公司合成。

表1 重組PCR引物Table 1 Recombinant PCR primers

1.4 2E8mE2融合蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

分別從重組質(zhì)粒pMD-2E8ScFv和pETmE2上擴增目的基因2E8ScFv和mE2。PCR擴增條件均為：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。以純化后的2E8ScFv和mE2基因為模板，采用重疊延伸PCR方法拼接2E8mE2融合基因。第一輪PCR反應(yīng)體系為：2E8ScFv和mE2基因各0.3 μL、10 mmol/L dNTPs 1 μL、10 × Buffer 2.5 μL、5 U/μL Taq 酶0.3 μL，用滅菌雙蒸水加至總體積25 μL。 PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸2 min，7個循環(huán)。當(dāng)?shù)谝徊椒磻?yīng)結(jié)束后，在反應(yīng)體系中加入引物2E8ScFv-F和mE2-R各0.3 μL，然后95℃預(yù)變性3 min；95℃變性1 min，61℃退火1.5 min，72℃延伸2 min，30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。將上述 PCR 產(chǎn)物純化回收后與 pMD18-T Simple載體連接，轉(zhuǎn)化TOP 10F'感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR及酶切鑒定后再測序驗證序列是否正確。用BamH I和Nhe I雙酶切重組質(zhì)粒，將2E8mE融合基因亞克隆到原核表達(dá)載體pET-DsbA中，構(gòu)建雙功能融合蛋白表達(dá)載體，將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化TOP 10F'感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR及酶切鑒定后測序，以確證其讀碼框是否正確。

1.5 2E8mE2融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及 SDS-PAGE分析

將 pET-DsbA-2E8mE2 融合蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)化BL21 (DE3) PlysS，取陽性轉(zhuǎn)化菌，以37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600值為0.5~1.0時，加入IPTG至終濃度為1.0 mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，離心收集1 mL菌體進(jìn)行SDS-PAGE分析，并用BandScan軟件測定目的蛋白相對含量。同時取表達(dá)菌液進(jìn)行超聲波破碎處理，分別收集沉淀和上清，沉淀用1 mol/L NaCl和0.5% Tritonx-100初步洗滌，再用8 mol/L尿素溶解，將上述尿素溶解液和上清樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析，檢測目的蛋白表達(dá)情況。

1.6 2E8mE2融合蛋白的純化與復(fù)性[10]

根據(jù) 1.5中的方法對收集的沉淀進(jìn)行洗滌和尿素溶解，因表達(dá)的融合蛋白上帶有6個組氨酸標(biāo)簽，因此用Ni-NTA-His-Bind 樹脂對其進(jìn)行純化，具體操作參照Qiangen公司的Ni-NTA蛋白純化說明書。洗滌緩沖液為：100 mmol/L NaH2PO4·H2O，10 mmol/L Tris-Cl，8 mol/L尿素，pH 6.3；洗脫緩沖液I為：100 mmol/L NaH2PO4·H2O，10 mmol/L Tris-Cl，8 mol/L尿素，pH 5.9；洗脫緩沖液 II為：100 mmol/L NaH2PO4·H2O，10 mmol/L Tris-Cl，8 mol/L尿素，pH 4.5。SDS-PAGE對純化后蛋白進(jìn)行分析。采用Bradford法測定純化后融合蛋白濃度，用緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，2 mmol/L EDTA，pH 8.5) 稀釋蛋白濃度至100 μg/mL以下，并使溶液中的尿素濃度保持在 l mol/L，然后加入還原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽，使其終濃度分別達(dá)到 l mmol/L和0.1 mmol/L，充分混勻，置于帶膠塞的瓶中用注射器抽氣后于16℃放置 20 h進(jìn)行復(fù)性。復(fù)性完成后，用20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.5) 緩沖液透析復(fù)性48 h，每6 h換液一次。用PEG20000濃縮復(fù)性蛋白，并測定其濃度。

1.7 Western blotting檢測

表達(dá)的融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分析后，轉(zhuǎn)移至NC膜上進(jìn)行Western blotting鑒定。一抗選擇兩種，分別為鼠源抗6 × His單克隆抗體 (2E8mE2融合蛋白帶有6個組氨酸標(biāo)簽) 和CSFV高免血清，對應(yīng)二抗分別為 HRP標(biāo)記的羊抗鼠 IgG和羊抗豬IgG，經(jīng)底物二氨基聯(lián)苯胺 (DAB) 顯色后分析。以誘導(dǎo)表達(dá)的空載體菌體蛋白為陰性對照。同時用PRRSV、SIV、PCV2、PRV和PPV陽性血清對融合蛋白進(jìn)行Western blotting檢測。

1.8 紅細(xì)胞凝集試驗檢測2E8mE2融合蛋白的生物學(xué)活性

取 20份 CSFV陽性血清 (經(jīng) IDEXX CSFV ELISA 抗體檢測試劑盒驗證)，按50 μL/每孔依次加入血凝板中，然后再向每個孔中依次加入20 μL雙功能蛋白 (500 μg/mL) 和 20 μL 2% O型人紅細(xì)胞，混勻，靜置30 min，觀察結(jié)果。分別設(shè)陰性蛋白 (經(jīng)過同樣處理的 PET-DsbA空載體表達(dá)蛋白DsbA)、20份CSFV抗體陰性血清 (經(jīng)IDEXX CSFV ELISA抗體檢測試劑盒驗證) 和其他常見豬病陽性血清為對照。分別取A、B和AB型人紅細(xì)胞代替O型人紅細(xì)胞，體系中其余成分及其加入量保持不變，按上述方法進(jìn)行操作，30 min觀察凝集現(xiàn)象。

2 結(jié)果

2.1 2E8mE2融合蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

以重組質(zhì)粒 pMD-2E8ScFv 和 pETmE2 為模板分別擴增出目的基因2E8ScFv和mE2。擴增產(chǎn)物大小分別為732 bp和393 bp，與預(yù)期擴增片段一致。以2E8ScFv和mE2基因片段為模板，通過重疊延伸PCR 將2E8ScFv和mE2拼接成2E8mE2融合基因(1125 bp)。將2E8mE2片段克隆到pMD18-T Simple載體上，鑒定正確后插入表達(dá)載體pET-DsbA，經(jīng)酶切及PCR鑒定，均可獲得大小約1125 bp的片段 (圖1)，測序結(jié)果表明該片段與融合基因2E8mE2一致，且已正確插入表達(dá)載體的閱讀框中。

2.2 2E8mE2融合蛋白的表達(dá)、純化及復(fù)性

選取pET-DsbA-2E8mE2轉(zhuǎn)化菌和pET-DsbA空載體對照菌進(jìn)行 IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果在 37℃、IPTG濃度為0.3 mmol/L、誘導(dǎo)3 h時獲得最大表達(dá)，表達(dá)量占菌體蛋白總量的30%左右。經(jīng)SDS-PAGE分析，該融合蛋白表達(dá)以包涵體為主，有少量的可溶性蛋白表達(dá) (圖略)，相對分子質(zhì)量約65 kDa (圖2)，與預(yù)期蛋白相符。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)包涵體洗滌、過柱純化后，蛋白純度能達(dá)到95%左右 (圖2)。純化后的包涵體經(jīng)谷胱甘肽法復(fù)性可得到具有生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)。Bradford法檢測復(fù)性濃縮后蛋白終濃度約為500 μg/mL。

2.3 Western blotting檢測

表達(dá)的2E8mE2融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移至 NC膜上，分別用抗 6×His單克隆抗體和CSFV高免血清進(jìn)行Western blotting檢測，結(jié)果在65 kDa處均出現(xiàn)一條特異性的抗原-抗體結(jié)合帶 (圖3A)，而同時用PRRSV、SIV、PCV2、PRV和PPV陽性血清對2E8mE2融合蛋白進(jìn)行Western blotting檢測，結(jié)果無任何免疫印跡帶出現(xiàn) (圖3B)，說明表達(dá)的融合蛋白能分別與抗 6×His單克隆抗體及CSFV高免血清發(fā)生特異性反應(yīng)。

圖1 重組質(zhì)粒pET-DsbA-2E8mE2的雙酶切鑒定Fig. 1 Identification of pET-DsbA-2E8mE2 by enzyme digestion. M: DNA marker 15000; 1: PET-DsbA-2E8mE2 digested with BamH I and Nhe I; 2: PCR product of 2E8mE2 fusion gene.

圖2 SDS-PAGE檢測純化的2E8mE2融合蛋白Fig. 2 SDS-PAGE analysis of purified 2E8mE2 fusion protein. M: protein marker; 1: negative protein control; 2: recombinant bacterium protein before being induced by IPTG; 3: recombinant bacterium protein after being induced by IPTG; 4: purified 2E8mE2 fusion protein.

圖3 2E8mE2融合蛋白的Western blotting檢測Fig. 3 Western blotting detection of 2E8mE2 fusion protein. (A) 6×His monoclonal antibody. M: protein marker; 1: recombinant bacterium protein after being induced by IPTG; 2: negative protein control. (B) Positive sera. M: protein marker; 1: PRRSV positive serum; 2: SIV positive serum; 3: PCV2 positive serum; 4: PRV positive serum; 5: PPV positive serum; 6: negative protein control; 7: CSFV positive serum.

2.4 紅細(xì)胞凝集試驗檢測2E8mE2融合蛋白的生物學(xué)活性

采用2E8mE2融合蛋白、2% O型人紅細(xì)胞、CSFV陽性血清進(jìn)行紅細(xì)胞凝集試驗，結(jié)果20份樣品均可觀察到強凝集現(xiàn)象 (圖4A)，而以空載體表達(dá)蛋白DsbA代替2E8mE2融合蛋白進(jìn)行同樣的試驗，未觀察到凝集現(xiàn)象 (圖4B)。用20份CSFV陰性血清與 2E8mE2融合蛋白作用后，均未發(fā)生凝集 (圖4C)。以A、B和AB型人紅細(xì)胞進(jìn)行上述同樣的試驗，結(jié)果也觀察到強凝集現(xiàn)象 (圖4D)。用PRRSV、SIV、PCV2、PRV和PPV陽性血清分別與2E8mE2融合蛋白作用，均未發(fā)生凝集 (圖4E)。說明2E8mE2融合蛋白具有與人紅細(xì)胞結(jié)合特性，無血型特異性，且只與CSFV陽性血清發(fā)生特異性結(jié)合。

3 討論

圖4 紅細(xì)胞凝集試驗Fig. 4 Erythrocyte agglutination test. (A) Erythrocyte agglutination test of 2E8mE2 fusion protein and CSFV positive sera and O type human red blood cells. (B) Erythrocyte agglutination test of negative protein and CSFV positive sera and O type human red blood cells. (C) Erythrocyte agglutination test of 2E8mE2 fusion protein and CSFV negative sera and O type human red blood cells. (D) Erythrocyte agglutination test of 2E8mE2 fusion protein and CSFV positive serum and human red blood cells. 1: A type human red blood cell; 2: B type human red blood cell; 3: AB type human red blood cell; 4: O type human red blood cell; 5: negative control. (E) Erythrocyte agglutination test of 2E8mE2 fusion protein and positive sera and O type human red blood cells. 1: PRRSV positive serum; 2: SIV positive serum; 3: PCV2 positive serum; 4: PRV positive serum; 5: PPV positive serum.

澳大利亞學(xué)者Kemp等于1988年在Science上發(fā)表文章首次提出了自體紅細(xì)胞凝集試驗的概念[1]。其主要原理是以被檢者自身的紅細(xì)胞作為指示細(xì)胞，加入通過化學(xué)交聯(lián)法制備的雙功能分子 (抗紅細(xì)胞單抗與HIV-1 gp4抗原肽的交聯(lián)蛋白)，如出現(xiàn)肉眼可見的紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象，就可判斷該被檢者已被HIV病毒感染，即血液中存在抗HIV-1 gp41的抗體。由于化學(xué)交聯(lián)法操作繁瑣，試劑不穩(wěn)定，易破壞抗體功能，使其應(yīng)用受到了限制。1994年，Lilley等[11]首次利用DNA重組技術(shù)，將抗人紅細(xì)胞單鏈抗體基因與編碼HIV-1 gp41蛋白中35個氨基酸的DNA片段重組，成功地制備出了可用作HIV-1快速診斷的雙功能試劑，彌補了化學(xué)交聯(lián)法的不足，此后被廣泛應(yīng)用于雙功能試劑的制備[12-14]。

由于目前對豬紅細(xì)胞表面抗原的種類及分布情況仍不十分清楚，因此本研究擬借助表面抗原背景清楚的人紅細(xì)胞作為指示劑，利用基因工程的方法將抗人紅細(xì)胞表面H抗原的單鏈抗體CSFV E2主要抗原區(qū)融合，構(gòu)建一種既能夠與人紅細(xì)胞結(jié)合、又能夠與CSFV抗體反應(yīng)的雙功能融合蛋白，建立紅細(xì)胞凝集試驗，用于豬瘟抗體的快速檢測。

近年來由于采用了分子內(nèi)伴侶技術(shù) (如 Trx和DsbA等) 使得許多功能基因能在 E. coli中正確折疊，就連結(jié)構(gòu)復(fù)雜的 tPA等也獲得了正確折疊的重組可溶性活性蛋白[15]。因此本研究選取 pET-DsbA表達(dá)載體，期望能夠獲得可溶的有活性的目的蛋白。然而試驗并未達(dá)到預(yù)期的效果，融合蛋白表達(dá)大部分是以不溶的包涵體形式存在。究其原因可能有二:其一，pET-DsbA載體并不適用于所有蛋白的可溶性表達(dá)；其二，本研究還未篩選到適合融合蛋白可溶性表達(dá)的最佳條件，有待進(jìn)一步研究。

融合蛋白以包涵體形式表達(dá)，雖然給后續(xù)工作帶來一定的困難，必須對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行復(fù)性來恢復(fù)其生物學(xué)功能。但也有其優(yōu)點：可以避免菌體蛋白酶對外源蛋白的降解；降低了胞內(nèi)外源蛋白的濃度，有利于表達(dá)量的提高；包涵體對超聲破碎和機械攪拌不敏感，易于破壁并與細(xì)胞膜碎片分離；包涵體中雜蛋白含量較低，通過離心就可以和可溶性蛋白分離，有利于分離純化[16]。

通過Western blotting與紅細(xì)胞凝集試驗已經(jīng)證實，本研究構(gòu)建的2E8mE2融合蛋白具有既與人紅細(xì)胞結(jié)合又與CSFV抗體反應(yīng)的雙功能性，為下一步建立豬瘟抗體的快速檢測的紅細(xì)胞凝集試驗打下了基礎(chǔ)。此外，在紅細(xì)胞凝集試驗中出現(xiàn)凝集現(xiàn)象的時間較長，與人血型檢測的速度仍有一段距離，估計與2E8mE2融合蛋白活性不高有關(guān)，這是否與本研究在構(gòu)建雙功能融合蛋白時，是將兩個功能區(qū)直接拼接，使得功能結(jié)構(gòu)域之間的相互遮掩而導(dǎo)致融合蛋白的活力下降有關(guān)？為此，將盡快開展下一步研究，在2E8ScFv與mE2免疫原性肽段之間連接一段 CHI片段 (來源于 2E8株單抗輕鏈恒定區(qū)序列)，以克服空間障礙，使與抗原肽緊密相連的單鏈抗體不再阻礙結(jié)合到紅細(xì)胞表面的雙功能融合蛋白與血清中相應(yīng)抗體之間的有效結(jié)合。

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