張楠，車鑒，白松，吳爭(zhēng)，崔玉影，鄒偉,2

1 遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，大連 116029

2 遼寧師范大學(xué) 遼寧省生物技術(shù)和分子藥物研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大連 116029

3 大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院放射科，大連 116011

ATM (Ataxia-telangiectasia mutated) 是共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張性癥 (Ataxia-telangiectasia, AT) 的突變基因，是一種腫瘤抑制基因，最初是在AT病中發(fā)現(xiàn)的。AT是一種罕見的常染色體隱性遺傳病，由AT基因突變所致。1995年，以色列遺傳學(xué)家Shiloh等確定AT病為單基因遺傳病，并將此致病基因命名為ATM基因[1]。

乳腺癌的發(fā)生是一個(gè)多階段、多因素參與的過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，與乳腺癌易感性相關(guān)的基因很多，如CHEK2、NBS1、RAD50、BRIP1、PALB2、BRCA1、BRCA2和ATM等[2]。近年來(lái)，對(duì)AT病例流行病學(xué)的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，女性AT患者乳腺癌發(fā)病率較高，因而ATM基因與乳腺癌的關(guān)系逐漸成為研究熱點(diǎn)之一。以下僅就ATM基因的結(jié)構(gòu)和功能及與乳腺癌易感性的關(guān)系加以綜述。

1 ATM基因的結(jié)構(gòu)和功能

1.1 ATM基因結(jié)構(gòu)及其編碼蛋白

ATM基因位于染色體11q22.3，長(zhǎng)度為150 kb，具有66個(gè)外顯子 (圖1)，第4外顯子為第一個(gè)編碼外顯子。ATM蛋白是ATM基因編碼的一種磷酸化的大分子核磷蛋白，含有3056個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為350.6 kDa，是磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)家族的一員[1]。

圖1 ATM基因在人染色體上的定位Fig. 1 Locations of the ATM genes and the utilized microsatellite markers in chromosome11q21-q24.

ATM蛋白的C端包括FRAP、ATM和TRAPP區(qū)域 (又稱FATC區(qū)域)，含有35個(gè)高度保守的殘基。這部分區(qū)域在調(diào)節(jié) ATM激酶活性和結(jié)合其他調(diào)節(jié)蛋白上起著關(guān)鍵性的作用[3]。ATM蛋白的N端含有HEAT區(qū)域，這些區(qū)域缺乏特征性的螺旋結(jié)構(gòu)，無(wú)定向特性并遠(yuǎn)離激酶功能域，被認(rèn)為是一些酶的結(jié)合區(qū)域，故可能會(huì)影響 ATM和其他蛋白的相互作用。ATM中還有一些螺旋和超螺旋結(jié)構(gòu)的功能域，功能尚不明確[4]。

ATM是一種主要在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)的蛋白激酶，也有研究指出其在不同組織和細(xì)胞中有不同的定位：在增殖細(xì)胞中，ATM主要在核內(nèi)表達(dá)，而在卵母細(xì)胞、大腦神經(jīng)元等分化細(xì)胞中ATM則主要在胞漿內(nèi)表達(dá)[5]。

1.2 ATM基因與臨床表現(xiàn)

AT患者臨床表現(xiàn)為漸進(jìn)性小腦共濟(jì)失調(diào)、皮膚和眼部瘤樣小血管擴(kuò)張、染色體不穩(wěn)定以及射線敏感性增高等。臨床上，有大約1/3的AT病人患癌癥，大都為淋巴樣惡性腫瘤，包括白血病、淋巴瘤和乳腺癌等[6]。新近的臨床研究表明，ATM 基因突變還可能是骨髓癌的重要致病原因之一[7]。

1.3 ATM基因的功能

ATM 在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中主要參與激活細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)、調(diào)控DNA的損傷修復(fù)及調(diào)控細(xì)胞凋亡等[8]。

Bakkenist等[9]研究發(fā)現(xiàn)，未受輻射的細(xì)胞內(nèi)，ATM以二聚體或者更高級(jí)的多聚體形式保持失活狀態(tài)，其激酶域束縛在絲氨酸1981位點(diǎn)所包繞的一個(gè)區(qū)域內(nèi)，當(dāng)DNA雙鏈斷裂 (DSBs) 發(fā)生后，通過(guò)絲氨酸1981位分子間磷酸化和Tip60乙酰轉(zhuǎn)移酶的乙酰化而形成有活性的單體激酶。研究顯示 MRN (Mre11、Rad50、Nbs1) 復(fù)合物是ATM的激活的主要調(diào)控因子。其中，Mre11具有核酸外切酶活性，而Rad50和Nbs1的作用是激活Mre11的酶活性[10]。MRN復(fù)合物可以感應(yīng)斷裂的產(chǎn)生，并與其他解旋酶及核酸外切酶切割DNA斷裂端的5′末端，產(chǎn)生一段3′粘端的單鏈DNA，這段寡核苷酸刺激ATM的構(gòu)象發(fā)生改變，從而形成有活性的單體激酶[11]。最近也有研究表明，ATM是被單鏈DNA結(jié)合蛋白hSSB1所激活。DNA斷裂端被MRN切割成寡聚單鏈DNA后與hSSB1結(jié)合，而hSSB1蛋白在單鏈DNA上富集才能激活 ATM 激酶的活性。在 hSSB1突變的T117E細(xì)胞中，不能檢測(cè)到ATM的磷酸化，同時(shí)，基因組的穩(wěn)定性也被破壞[12]。

ATM作為起始調(diào)控DNA損傷反應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的核心分子，感受DNA損傷位點(diǎn)，并使其下游多種蛋白磷酸化，例如Chk2、p53、c-Abl和RPA等，它們參與細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)使受損的 DNA停滯于細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)并對(duì)其進(jìn)行修復(fù)[13]。Chk2是ATM下游的重要蛋白激酶，ATM激活后，磷酸化位于N末端的68位蘇氨酸而活化Chk2。Chk2激酶在G1/S、S和G2/M期均可被激活，通過(guò)磷酸酶Cdc25家族的活化而抑制不同細(xì)胞周期蛋白 Cyclin與CDK復(fù)合物的磷酸化作用，從而阻滯細(xì)胞周期中各個(gè)時(shí)期的進(jìn)程[14]。

DNA雙鏈斷裂 (DSBs) 是DNA損傷類型中較為嚴(yán)重的一種，細(xì)胞應(yīng)對(duì) DSBs主要有兩種類型：同源重組修復(fù) (Homologous recombination repair，HR) 和非同源末端連接 (Non-homologous end joining，NHEJ)。ATM主要介導(dǎo)HR修復(fù)通路。ATM基因缺陷型的小鼠表現(xiàn)明顯的 HR修復(fù)障礙[15]?？Х纫蛞种艫TM后會(huì)顯著降低DSB誘導(dǎo)的HR通路的修復(fù)途徑[16]。

ATM 可以磷酸化 p53，并通過(guò)其下游的 Bcl-2介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。p53是一種抑癌蛋白，在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中起重要的作用。p53可以誘導(dǎo)DNA損傷細(xì)胞進(jìn)入G1期，抑制細(xì)胞增殖，直到修復(fù)結(jié)束。如果修復(fù)失敗，p53則誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17]。研究表明，乳腺癌細(xì)胞中，ATM可以磷酸化p14ARF。p14ARF是p53介導(dǎo)抑癌機(jī)制中的關(guān)鍵因子，其表達(dá)可使p53的15位絲氨酸磷酸化，激活p53活性，進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖。RNAi干擾ATM表達(dá)后，p14ARF誘導(dǎo)的p53磷酸化程度顯著降低，表明ATM通過(guò)p14ARF調(diào)節(jié)p53活性[18]。

綜上所述，ATM對(duì)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控有兩方面的作用：1) 啟動(dòng)細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)并介導(dǎo)其修復(fù)，使細(xì)胞恢復(fù)生理功能；2) 啟動(dòng)細(xì)胞凋亡進(jìn)程，使細(xì)胞免于惡性轉(zhuǎn)化。因此ATM基因功能的改變或缺失后，致使細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)和DNA損傷修復(fù)的異常、凋亡敏感性增加、染色體不穩(wěn)定及輻射敏感性增強(qiáng)，從而導(dǎo)致癌癥易感性增加。

2 ATM基因與乳腺癌

2.1 ATM在乳腺組織中的表達(dá)

乳腺結(jié)構(gòu)中有兩種不同的上皮細(xì)胞，其中一種為分泌導(dǎo)管上皮細(xì)胞，另一種為收縮性的肌上皮細(xì)胞。在正常乳腺組織中，ATM主要表達(dá)于乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞中，而在肌上皮細(xì)胞中幾乎檢測(cè)不到ATM的表達(dá)。但在硬化性乳腺病中，ATM在乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞和肌上皮細(xì)胞中均有表達(dá)。此外在30%~50%的擴(kuò)散性乳腺腫瘤上皮細(xì)胞中，ATM表達(dá)減少或缺失[19]。

ATM 蛋白的表達(dá)水平在乳腺癌中低于正常組織，可能是因?yàn)锳TM基因啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生了異常的甲基化[20]。另外，ATM的表達(dá)下調(diào)也可能與DNA-PK的表達(dá)下調(diào)有關(guān)。Peng等[21]在一些細(xì)胞中用 RNAi技術(shù)降低DNA-PK的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ATM的mRNA表達(dá)水平降低，從而導(dǎo)致ATM蛋白表達(dá)下調(diào)，但其具體機(jī)制尚未清楚。本研究室同樣利用RNAi技術(shù)，降低MCF10F細(xì)胞株中DNA-PK的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ATM蛋白的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組[22]。

2.2 ATM基因和乳腺癌的易感性

自ATM基因被克隆出時(shí)，研究者通過(guò)分子水平的研究后便指出，ATM基因有可能增加乳腺癌的易感性[1]。盡管不是所有的后續(xù)研究都能確定ATM基因和乳腺癌的關(guān)系[23]，但在 AT患者家族中乳腺癌的確有較高的患病風(fēng)險(xiǎn)。Thompson等[24]發(fā)現(xiàn)在AT患者家族中，乳腺癌的發(fā)病率是正常人群的2.23倍。Olsen等[25]對(duì)75例AT患者及其血緣親屬進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)乳腺癌的發(fā)病率較高地集中在生育 AT病患兒的母親中，而在其他女性親屬中并不明顯。他們提出這種現(xiàn)象可能的原因是生育一個(gè) AT患兒會(huì)增加其母親的乳腺癌患病風(fēng)險(xiǎn)。因此在乳腺癌的研究中，ATM一直作為熱點(diǎn)研究基因。

2.2.1 ATM基因突變和乳腺癌

近年來(lái)，許多研究組報(bào)道了關(guān)于ATM基因突變與乳腺癌易感性的關(guān)系。

Renwick等[26]在家族性乳腺癌中對(duì)ATM基因和乳腺癌的關(guān)系進(jìn)行研究，排除了 CHEK2、BRCA1和BRCA2乳腺癌易感基因突變的影響，在443例乳腺癌患者中檢測(cè)出12種ATM基因突變類型，而在521例對(duì)照組中只有2種突變類型，證明ATM是乳腺癌的易感基因，并指出ATM基因突變將會(huì)提高乳腺癌的發(fā)生率。Brunet等[27]在 43例未發(fā)生BRCA1和BRCA2基因突變的乳腺癌中研究了ATM基因的突變情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了34種ATM基因突變類型。通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬分析，其中有些突變類型會(huì)影響外顯子的剪接和ATM蛋白的功能。因此，增加了乳腺癌的易感性。Paglia等[28]用增強(qiáng)型錯(cuò)配突變分析法(EMMA) 對(duì) 122例家族性乳腺癌患者基因進(jìn)行分析，篩選出了 28種 ATM基因的突變類型。其中c.7789G＞T的突變率在患者中為6.65%，而在對(duì)照組中僅為0.3%~0.6%。Tavtigian等[29]研究發(fā)現(xiàn)，一些低頻的 ATM基因錯(cuò)義置換會(huì)增加乳腺癌的易感性。他們認(rèn)為，這些錯(cuò)義置換破壞了 ATM蛋白中FAT、激酶和FATC結(jié)構(gòu)域的比例，致使ATM蛋白功能改變，從而增加乳腺癌易感性。這項(xiàng)研究采用元分析法，重新統(tǒng)計(jì)了曾經(jīng)發(fā)表的ATM基因突變與乳腺癌的相關(guān)性的數(shù)據(jù)結(jié)果，并在此基礎(chǔ)上增加了一些病例與對(duì)照組的研究，得出的結(jié)論解決了單一實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)低頻錯(cuò)義置換基因結(jié)果統(tǒng)計(jì)的局限性問題[30]。

除了分析整個(gè)ATM基因編碼區(qū)之外，許多研究小組在乳腺癌病例對(duì)照組中分析單個(gè)ATM基因變異頻率。Stredrick等[31]曾發(fā)現(xiàn)，乳腺癌中 ATM 基因Ser49Cys錯(cuò)義突變率較高，尤其在50歲以下的女性患者中多見。美國(guó)和波蘭的兩個(gè)研究團(tuán)隊(duì)也得到了相似的結(jié)果。Bogdanova等[32]研究了東歐一些國(guó)家乳腺癌的病例，發(fā)現(xiàn)許多患者ATM基因E1978X位點(diǎn)發(fā)生了突變。進(jìn)一步分析表明，該位點(diǎn)的突變患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)比對(duì)照組高約5倍。這些結(jié)論均支持了ATM是乳腺癌的易感基因。

當(dāng)然不是所有的研究都指向ATM基因突變會(huì)增加乳腺癌的易感性。Dombernowsky等[33]在研究ATMSer49Cys基因的突變與癌癥的關(guān)系時(shí)指出，該位點(diǎn)的基因突變可能會(huì)增加其他類型癌癥的患病風(fēng)險(xiǎn)，但并不能增加患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)。

2.2.2 ATM基因多態(tài)性和乳腺癌

基因多態(tài)性通常是指單核苷酸多態(tài)性 (SNP)分析后，等位基因頻率 (MAF) 大于 5%的基因突變。乳腺癌病例除了與BRCA1、BRCA2等易感基因的突變有關(guān)之外，低外顯率的易感基因如代謝酶基因、DNA損傷修復(fù)基因、細(xì)胞因子以及抑癌基因等在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、治療與預(yù)后也起到了重要的作用[34-35]。

Angele 等[36]的 臨床 研究發(fā) 現(xiàn) ATMex39 5557G>A(D1853N) 可增加由射線誘導(dǎo)的乳腺癌的發(fā)病機(jī)率。Heikkinen等[37]對(duì) ATMex39 5557G>A (D1853N) 及其順位基因 ATMivs38-8T>C多態(tài)性和乳腺癌的關(guān)系進(jìn)行研究時(shí)，推測(cè)這種復(fù)雜的等位現(xiàn)象在一定程度上會(huì)影響外顯子39的正確剪接。雖然沒有發(fā)生異常的轉(zhuǎn)錄激活現(xiàn)象，但這樣的雜合子患者淋巴母細(xì)胞中的 ATM蛋白表達(dá)水平比未攜帶雜合子的人低，而ATM蛋白的低表達(dá)會(huì)直接影響DNA的損傷應(yīng)答途徑，繼而影響基因組的穩(wěn)定性。因此，他們認(rèn)為5557G>A和ivs38-8T>C對(duì)乳腺癌的發(fā)病率有一定影響。Tommiska等[38]繼續(xù)研究ATMivs38-8T>C和 ATMex395557G>A(D1853N) 的多態(tài)性與乳腺癌的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者中ivs38-8T>C突變基因的攜帶者要略高于對(duì)照組 (攜帶組為 8.1%，對(duì)照組為 5.6%)。這些都說(shuō)明，ATMivs38-8T>C和 ATMex395557G>A(D1853N) 的多態(tài)性與乳腺癌的易感性相關(guān)。

Lee等[39]通過(guò)測(cè)序確定了ATM基因中5個(gè)多態(tài)性位點(diǎn) (-5144A>T、IVS21+l049T>C、IVS33-55T>C、IVS34+60G>A、3393T>G)。他們認(rèn)為這5個(gè)位于非編碼區(qū)域的多態(tài)性位點(diǎn)，會(huì)在不同程度上影響外顯子11的正確連接，導(dǎo)致氨基酸殘基419位的截短。用Bayesian方法評(píng)價(jià)基因庫(kù)中的單倍型，發(fā)現(xiàn)病例組與對(duì)照組的單倍型頻率明顯不同。而且進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn) ATM 基因中的 IVS21+1049TC/CC、IVS34+60GA/AA、3393TG/GG基因型與絕經(jīng)前乳腺癌婦人患病風(fēng)險(xiǎn)的增加有關(guān)。

Ho等[40]研究了 131例乳腺癌患者，檢測(cè)出 51例患者存在ATM多態(tài)性基因型。與其余的80例患者相比，ATM多態(tài)性基因型患者表現(xiàn)出更高的輻射耐受性。結(jié)果表明ATM基因多態(tài)性可能會(huì)影響治療乳腺癌的輻射敏感性。

2.2.3 ATM基因甲基化和乳腺癌

隨著表遺傳學(xué) (Epigenetics) 的發(fā)展，近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化的機(jī)制與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，DNA甲基化狀態(tài)的改變導(dǎo)致基因結(jié)構(gòu)和功能的異常。研究表明，DNA啟動(dòng)子區(qū)域甲基化對(duì)基因表達(dá)有抑制作用，經(jīng)常導(dǎo)致相關(guān)疾病和腫瘤的發(fā)生[41]。ATM基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化與許多癌癥相關(guān)。Kim等[42]發(fā)現(xiàn)，射線輻射引起的ATM基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化與直腸癌的易感性相關(guān)。Ai等[43]在研究中發(fā)現(xiàn)，頭頸扁平上皮癌中ATM基因啟動(dòng)子甲基化頻率較高。

由于甲基化是可逆的過(guò)程，可以通過(guò)去甲基化恢復(fù)基因的表達(dá)和功能。因而ATM基因甲基化與乳腺癌易感性已逐漸成為研究熱點(diǎn)。

Flanagan等[44]對(duì)雙側(cè)乳腺癌患者外周血液DNA中ATM基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化進(jìn)行了研究，他們?cè)谟?guó)乳腺癌研究中心的種族和年齡匹配的 190個(gè)病例對(duì)照組 (雙側(cè)乳腺癌-未患乳腺癌) 中，提取外周血液的DNA，通過(guò)焦磷酸測(cè)序研究了ATM基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化，發(fā)現(xiàn)患者血液中該區(qū)域甲基化程度高于對(duì)照組。并且在啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化可變位點(diǎn)發(fā)生頻率較高。這項(xiàng)研究結(jié)果提示乳腺癌患者的外周血液中存在ATM基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化現(xiàn)象。提示，外周血液中ATM基因去甲基化可能成為治療乳腺癌的新型方法之一。

但是乳腺癌中ATM基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化還是存在爭(zhēng)議的。Brandes等[45]通過(guò)使用特異MSP引物設(shè)計(jì)的PCR方法檢測(cè)了乳腺癌中ATM基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化。他們所設(shè)計(jì)的引物與Kim等和Ai等設(shè)計(jì)的不同。原因是Kim和 Ai設(shè)計(jì)的引物中缺少了非CpG島的胞嘧啶，因而對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定的影響。通過(guò)這樣的特殊引物設(shè)計(jì) Brandes認(rèn)為至少在他們所檢驗(yàn)的43例乳腺癌中沒有發(fā)現(xiàn)ATM基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化。

3 展望

ATM基因作為DNA修復(fù)通路的修復(fù)基因之一，在繼BRCA1、BRCA2、TP53和CHEK2之后被認(rèn)為是乳腺癌易感基因之一，其通過(guò)相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，介導(dǎo)特定的分子間相互作用，繼而激活或抑制相應(yīng)的細(xì)胞因子。雖然目前關(guān)于ATM基因與乳腺癌易感性的研究已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但關(guān)于其確切的關(guān)系，還存在一定的爭(zhēng)議，需在各種生理及病理?xiàng)l件下進(jìn)行更深入的研究。因此，對(duì)ATM基因突變、甲基化、多態(tài)性等諸方面與乳腺癌易感性的關(guān)系進(jìn)行進(jìn)一步了解與研究具有重要意義，并為乳腺癌的預(yù)防和治療提供新的思路和理論基礎(chǔ)。

目前，如何提高腫瘤細(xì)胞的放射敏感性，是人們致力解決的問題。“基因聯(lián)合放射治療”為惡性腫瘤的放射治療提供了新的思路。ATM基因突變后的放射敏感性是其特點(diǎn)之一，但如果在乳腺癌的治療中用人工方法造成類似的 ATM 基因突變或抑制ATM基因功能來(lái)增加患者的放療敏感性，可能成為乳腺癌治療的一個(gè)良好策略。

基因甲基化在乳腺癌診斷中應(yīng)用的最大問題是確定候選靶基因。選取最具有乳腺癌代表性的基因是該項(xiàng)技術(shù)是否能得到充分應(yīng)用的最大門檻。盡管目前關(guān)于ATM基因甲基化與乳腺癌易感性的研究還處于發(fā)展階段，但隨著表遺傳學(xué)研究的深入，相信ATM基因甲基化在乳腺癌的診斷中一定會(huì)有可觀的應(yīng)用前景。

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