林森,周紅利,聶政

(1.成都醫(yī)學院人體解剖與組胚教研室,成都 610083;2.成都醫(yī)學院“發(fā)育與再生”四川省重點實驗室,成都 610083)

皮膚創(chuàng)傷愈合過程不僅僅依賴于表皮干細胞的增生和分化,當表皮嚴重受損時HFSC可向創(chuàng)傷部位遷移,可能形成新的表皮細胞促使傷口愈合[1-6]。多種細胞參與皮膚創(chuàng)傷修復過程。在創(chuàng)傷后幾小時,表皮細胞開始增生并遷移以覆蓋暴露的傷口進行再上皮化修復,大量的細胞因子參與愈合過程。有研究發(fā)現(xiàn),β神經(jīng)生長因子由成纖維細胞、角質(zhì)形成細胞和肥大細胞等駐留細胞產(chǎn)生,起重要的生理作用,此因子在隆突區(qū)的增強可能對毛囊肝細胞的分化和組織修復有重要意義[7]。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

光學顯微鏡(Olym pus),磁力攪拌器(江蘇海門儀器),電子天平(Sartorius),-20℃低溫冰箱(Siemens),-80℃低溫冰箱(Sanyo),純水系統(tǒng)(Millipore),冰凍切片機(Leica,德國)。DAB(北京中山生物技術(shù)),β-NGF ELISA試劑盒(武漢博士德),OCT包埋劑(Leica,德國),PBS粉末,抗體稀釋液SP-9001抗兔免疫組織化學試劑盒,SP-9002抗鼠免疫組織化學試劑盒都購自(北京中杉金橋生物技術(shù)公司),小鼠抗K 15多克隆抗體(Novocastra),兔抗β1-integrin多克隆抗體(武漢博士德),兔抗CD34多克隆抗體(武漢博士德),兔抗β-NGF多克隆抗體(武漢博士德),兔抗p75NTR多克隆抗體(北京博奧森)。

1.2 實驗方法

1.2.1 制作在體創(chuàng)傷模型 選取7 d齡SD乳鼠,同一時間用外科手術(shù)刀切除新生鼠雙側(cè)唇部表皮全層組織,深達真皮,可見裸露毛囊頭部。

1.2.2 取材 分別在創(chuàng)傷后2、4、6、8、10、12 h取雙側(cè)唇部組織進行相應指標檢測。并在每個時間點使用蘇木精-伊紅(HE)染色觀察表皮愈合情況。同時在同窩新生鼠中按照上述時間點取相應的正常唇部組織作為對照,進行相同指標檢測。所有切片進行冰凍切片,厚度6μm,丙酮后固定。

1.2.3 創(chuàng)傷組織和正常組織的HFSC定位以及β-NGF及p75NTR的檢測 采用免疫組織化學方法,所有切片進行冰凍切片,4℃下丙酮后固定。取冰凍切片,常溫下晾干,待濕氣消散后用PBS洗4 min×3,37℃下3%H 2O2封閉20m in,PBS洗4 min×3,封閉液(2%羊血清)室溫孵育30 min,吸去封閉血清,勿洗,添加β神經(jīng)生長因子抗體(1∶200),一抗(設(shè)PBS空白對照)。所有切片37℃孵育1 h后再進行4℃濕盒內(nèi)過夜孵育,次日PBS漂洗4 min×4,加生物素化二抗,37℃孵育40min,PBS洗4min×3,加三抗,37℃孵育40 min,PBS洗4min×3,滴加DAB顯色液,顯微鏡下觀察顯色結(jié)果。充分沖洗,干燥脫水,二甲苯透明,中性樹脂封固。其他一抗為K 15(1：70)、β1-integrin(1∶100)及CD34(1∶100)和p75NTR(1∶100),方法類同。

1.3 圖象分析

使用Olympus全自動數(shù)碼鏡頭采集圖像,以目標染色區(qū)域陽性強度雙盲法即陰(0)、弱(1)、中(2)、強(3)和很強(4)來分析所有切片陽性平均值。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用Spss11.0對數(shù)據(jù)進行one-way and twoway ANOVA分析檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義,P＜0.01為差異具有顯著性統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色觀察表皮全層切除已經(jīng)愈合情況

早期愈合過程中(圖1),全層表皮切除后,可見創(chuàng)傷愈合短時期,即2～12 h的情況。2 h時表皮全層已經(jīng)切除,而12 h時期表皮正在愈合,有肉芽組織出現(xiàn),上層表皮與真皮組織結(jié)合不緊密,結(jié)締組織出現(xiàn)。毛囊隆突區(qū)變化較小,隆突區(qū)各層細胞無明顯的形態(tài)學變化。

2.2 檢測表皮全層損傷后毛囊隆突區(qū)的β-NGF、p75NTR、K 15、CD34和β1-integrin表達

β-NGF在2～10 h表達平穩(wěn),但是到創(chuàng)傷后12 h呈下降趨勢(圖2,3)。而p75NTR在創(chuàng)傷初始階段4 h表達升高,隨即平穩(wěn)至12 h。對于β1-integrin,CD34和K 15呈先抑后揚式表達,即在6 h時略有降低,隨后8 h時增高,但都在10 h和12 h時間點呈降低多趨勢(圖2,3)。

正常對照組呈現(xiàn)β-NGF平穩(wěn)表達,無明顯變化;p75NTR表達逐漸升高,在10 h達到最高,隨即下降;干細胞標志物CD34,K 15和β1-integrin則在2～12 h期間平穩(wěn)表達,其波動差別無顯著統(tǒng)計學意義圖3。

3 Spss 11.0 two-way ANOVA統(tǒng)計分析結(jié)果

3.1 組內(nèi)分析結(jié)果

全層表皮創(chuàng)傷后β-NGF的變化在2～12 h時間點與其他時間點無顯著差異。在8 h時毛囊外根鞘均勻表達β-NGF,隆突區(qū)表達強度與其他部分基本一致;12 h時β-NGF表達在外根鞘最外層,隆突區(qū)表達強度比其他部分大(圖3)。

β-NGF的變化在2～12 h時間點無明顯差異(P＞0.05)(圖3)。β1-integrin的變化在12 h與其他時間點有顯著差異(P＜0.05)(圖3)。

p75NTR的變化在2、4、6 h與其他時間點有顯著差異(P＜0.05)(圖3)。

CD 34的變化在4 h、與其他時間點有顯著差異(P＜0.05)(圖3)。

K 15的變化則在6、12 h與其他時間點有顯著差異(P＜0.05)(圖3)。

圖1 表皮全層創(chuàng)傷后2～12 h愈合過程(HE染色×200)Fig.1 Haling process ofepiderm is full thickness after trauma 2-12 hous

3.2 組間分析結(jié)果

全層表皮創(chuàng)傷后β-NGF與對照組相比無顯著變化;β1-integrin與對照組相比在2～12 h無顯著變化;p75NTR與對照組相比在4 h變化顯著;CD34與對照組相比在2～12 h無顯著變化;K 15與對照組相比在6、12 h變化顯著。

4 討論

當創(chuàng)傷發(fā)生后,創(chuàng)面臨近的KC自我更新過程被打斷。KC被激活,這意味著KC分泌各種細胞因子和生長因子,同時自身對這些因子產(chǎn)生應答。最終,對這些因子的應答改變了KC表型,使KC成為激活狀態(tài)KC[8]。在創(chuàng)傷愈合過程中,許多細胞以及因子發(fā)揮重要的生理作用,參與創(chuàng)傷修復。以往研究認為表皮的創(chuàng)傷修復主要依賴于表皮干細胞的增生、遷移和分化作用。但一直有研究表明,毛囊內(nèi)干細胞同樣可以向上增生、遷移和分化,對創(chuàng)傷愈合過程產(chǎn)生重要的生理作用。研究發(fā)現(xiàn)在成人皮膚中存在多個干細胞庫,包括毛囊隆突區(qū)、毛囊間上皮組織KC(keratinocytes of interfollicular epiderm is,IFE)和皮脂腺[9]。一系列研究證明表皮中多潛能干細胞的主要來源為HFSC隆突區(qū),補充毛囊、IFE和皮脂腺單位細胞譜系[4,10]。因此本文對表皮進行全層切除以激活毛囊隆突區(qū)干細胞,觀察HFSC對創(chuàng)傷愈合修復作用,以及HFSC表達的β-NGF和p75NTR對創(chuàng)傷修復可能產(chǎn)生的作用。

4.1 隆突區(qū)β-NGF和p75NTR的變化

本文挑選四個顯著差異的創(chuàng)傷時期來展示隆突區(qū)β-NGF和p75NTR的變化。其中β-NGF在創(chuàng)傷后2～12 h的毛囊隆突區(qū)無顯著降低,其他時間點基本保持一致。這說明2～10 h時期HFSC表達的β-NGF無顯著變化。但是在12 h時間點下,β-NGF的表達與對照組相比有顯著的降低。與此同時,HFSC特異性標志物β1-integrin、CD34和K 15的表達在臨近12 h時期不同程度地降低,這提示β-NGF的12 h時期表達變化與HFSC的干細胞性質(zhì)轉(zhuǎn)變有關(guān)。以往研究發(fā)現(xiàn),表皮受損時,HFSC會被激活,向創(chuàng)傷部位遷移、增生和分化為表皮細胞,修復創(chuàng)傷部位[1-6]。根據(jù)本研究所得結(jié)果,我們判斷HFSC可能已經(jīng)發(fā)生遷移,因此所表達的β-NGF降低,同時β1-integrin的降低同樣說明HFSC的黏附分子減少,黏附力下降,可能發(fā)生遷移趨勢。如果進行細胞標記追蹤來驗證此結(jié)果,效果會更佳。結(jié)合以往認為β-NGF在創(chuàng)傷修復中的作用[11-13],我們認為HFSC合成的β-NGF間接分泌到胞外,對創(chuàng)傷愈合起作用。Hasan等[14]研究發(fā)現(xiàn)在新生鼠表皮中β-NGF在創(chuàng)傷后2 d表達較高,這與本研究結(jié)果β-NGF在毛囊隆突區(qū)表達降低正相反,提示HFSC對于創(chuàng)傷愈合的修復方式可能不同于單純表皮細胞參與創(chuàng)傷愈合方式。按照遷移理論,隆突區(qū)HFSC受到刺激后離巢,向表皮遷移,分化為TA細胞和表皮細胞,填補創(chuàng)傷區(qū)域。正常的β-NGF表達則為持續(xù)同一個水平,48 h無下降趨勢。

p75NTR的表達在4 h與正常組有顯著差異,這說明該受體的變化比β-NGF頻繁。在4 h時期的突然升高可能說明此時對β-NGF以及其他神經(jīng)營養(yǎng)因子的應答增強,結(jié)合隆突區(qū)含有至少25種不同類型的密集表皮神經(jīng)末梢[15-17]以及短時期的恢復(8 h恢復正常水平),我們推測這種突然增強可能與神經(jīng)末梢的瞬時信息傳遞有關(guān)。這種短時期間隔的HFSC對創(chuàng)傷修復作用目前尚無相關(guān)文獻報道。Peters等[18]發(fā)現(xiàn)p75NTR能夠抑制毛囊的生長,促進其退化發(fā)生,誘導毛囊由生長期進入退化期,本文研究發(fā)現(xiàn)在正常組中,p75NTR表達逐漸增強,參照Generini等[13]定義毛囊發(fā)生的時期,我們認為隆突區(qū)表達的p75NTR同樣促進了毛囊進入退化期。p75NTR在4 h的顯著升高,說明β-NGF受體之一的p75NTR可能參與了早期炎癥激活或者是其他效應,但還需要進一步的驗證和實驗。

4.2 HFSC特異性標志物β1-integrin、CD34和K15的變化

實驗組中β1-integrin與正常組比較在12 h變化顯著,創(chuàng)傷后隆突區(qū)β1-integrin在12h表達下降,在后期研究中發(fā)現(xiàn)18 h增強(data not shown)。由于β1-integrin為細胞黏附分子,因此我們推測HFSC的遷移從創(chuàng)傷后12 h前就已經(jīng)開始。相關(guān)文獻證明在表皮全層切除后第3天創(chuàng)傷邊緣的棘層和顆粒層有散在的表達β1-integrin的細胞出現(xiàn),并且該種類細胞的數(shù)量在不斷增加[19]。結(jié)合HFSC在外根鞘70～100μm/d遷移距離以及表皮與毛囊隆突區(qū)的距離,我們推測表皮創(chuàng)緣逐漸增加的β1-integrin可能來自于隆突區(qū)HFSC。

CD34是細胞表面標志分子之一,一直以來是胚胎干細胞,血管細胞和其他多種細胞的標志物,同樣也可作為外根鞘細胞的特異標志物。在正常組中表達基本穩(wěn)定,而在實驗組中卻呈現(xiàn)中間弱,兩端高的趨勢。我們推測這種原因與HFSC部分遷移后造成的短期干細胞分裂不平衡,干細胞巢逐漸補充干細胞數(shù)量有關(guān)。

K 15為隆突區(qū)干細胞的特異性標志物,在創(chuàng)傷后6、12 h與正常組有顯著差異。以往干細胞相關(guān)研究結(jié)果表明,創(chuàng)傷因素會造成基底層中K 15(K 15為成熟基底層細胞KC表型)的降低,提示創(chuàng)傷為促使細胞分化的因素[20]。一個干細胞分裂為一個TA細胞和一個干細胞子代。TA細胞不斷遷移,而干細胞則駐留在干細胞巢。結(jié)合β1-integrin和CD34在部分時間點的表達趨勢,我們從另一種方向推測表皮全層的創(chuàng)傷同樣能夠刺激隆突區(qū)的干細胞分化遷移。標志物的變化可能同樣與干細胞的數(shù)量以及分裂速度有關(guān)。因此,本文中3種特異性標志物的協(xié)同變化一定程度上能夠說明干細胞在應對創(chuàng)傷愈合修復時的應激性反應。免疫組織化學方法研究可從形態(tài)學角度描述組織的變化,但結(jié)論較單一,下一步的研究應采用BrdU標記毛囊干細胞的方法,展示遷移和分化過程,追蹤其受到創(chuàng)傷激活后的變化。另外,可采用流式細胞儀對干細胞進行定量定性研究,使研究更加縝密和詳盡。

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