梁亞杰,李淑蓉,林森,周紅利,郭強(qiáng),蘇炳銀＊

(1.成都醫(yī)學(xué)院發(fā)育與再生四川省重點實驗室,人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室,成都 610083;2.第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部神經(jīng)生物學(xué)教研室;3.成都醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室,成都 610083)

近年來對A lzheimer病(AD)和Parkinson病(PD)等神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變的研究證實,炎癥在疾病的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮了關(guān)鍵作用,在這些疾病中均發(fā)現(xiàn)顯著的膠質(zhì)細(xì)胞增生和炎性介質(zhì)表達(dá),如腫瘤壞死因子(TNF)-α,白介素(IL)-1β,IL-6等;同時,多項臨床試驗表明,非甾體類抗炎藥能顯著降低AD和PD的發(fā)病率[1,2]。神經(jīng)系統(tǒng)炎癥的一個典型特征即膠質(zhì)細(xì)胞增生,包括小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化和增生。作為腦內(nèi)的免疫細(xì)胞,小膠質(zhì)細(xì)胞在各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用越來越得到重視[3]。小膠質(zhì)細(xì)胞在正常情況下處于靜息狀態(tài),監(jiān)視周圍環(huán)境中的危險信號,對腦內(nèi)的病理變化非常敏感。在病原體侵入,出現(xiàn)外界物質(zhì),神經(jīng)元損傷等情況下會迅速活化,從多分支狀變?yōu)榘⒚装蜆蛹?xì)胞,發(fā)揮吞噬功能,和(或)分泌一系列可溶性因子,包括細(xì)胞因子、氧自由基、趨化因子、脂肪酸代謝產(chǎn)物(如前列腺素)等[4]。

既往文獻(xiàn)報道,在PD患者腦標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)黑質(zhì)部位有小膠質(zhì)細(xì)胞活化[5],其后的研究也在PD患者黑質(zhì)中發(fā)現(xiàn)很多與炎癥相關(guān)的因子,包括TNF-α,IL-1β,iNOS等[6]。起初曾認(rèn)為小膠質(zhì)細(xì)胞活化僅發(fā)生在DA神經(jīng)元大量死亡后,是一個相對較晚出現(xiàn)的事件,但近年的研究發(fā)現(xiàn),小膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)元損傷中發(fā)揮了重要作用,并非僅發(fā)生在PD晚期。在PD的實驗動物模型中,MPTP,6-OHDA,百草枯(paraquat)等都可以造成DA神經(jīng)元的特異損傷,損傷初期即會誘發(fā)小膠質(zhì)細(xì)胞的顯著活化,并通過其分泌的物質(zhì)加重神經(jīng)元損傷;同時發(fā)現(xiàn)利用內(nèi)毒素(LPS)直接活化小膠質(zhì)細(xì)胞也能造成DA神經(jīng)元死亡。這些研究結(jié)果提示小膠質(zhì)細(xì)胞活化對神經(jīng)元具有很強(qiáng)的損傷作用[4]。我們的研究發(fā)現(xiàn)紋狀體和黑質(zhì)(SNc)內(nèi)神經(jīng)元均有神經(jīng)元死亡,鑒于小膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)系統(tǒng)炎癥及損傷中的重要作用,我們采用免疫熒光共聚焦圖像三維重建觀察黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元,少突膠質(zhì)細(xì)胞,星形膠質(zhì)細(xì)胞的位置關(guān)系及相互作用,現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及建立神經(jīng)元模型

雄性C57BL/6小鼠,22～25 g,購于第三軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科學(xué)研究所動物中心。將小鼠隨機(jī)分組進(jìn)行腦內(nèi)定位注射。戊巴比妥麻醉小鼠,置于小鼠腦立體定位儀,切開頭皮,以0.3%雙氧水處理頂骨表面組織,暴露前囟(Bregma),以之為標(biāo)準(zhǔn)點,將微量注射器移動到下列位置：中線旁開2 mm,前囟前方0.26 mm,標(biāo)記針頭在頂骨表面的位置點,以針頭在此點鉆孔,以頭骨表面為起始點,將注射器下降3mm。秋水仙堿被溶解在生理鹽水中(1 mg/m l),總體積0.5μl,在2 min內(nèi)注射到紋狀體,留針5 min。對照側(cè)以同樣的坐標(biāo)和同樣的方法注射生理鹽水。

1.2 形態(tài)學(xué)觀察

藥物注射1周后,以4%PFA經(jīng)心臟灌注小鼠,取腦進(jìn)行后固定和脫水。將含有SNc的中腦置于含4%PFA的0.1 mol/L PB(pH 7.4,4℃)后固定2～3 d,而后轉(zhuǎn)移至4℃30%蔗糖0.1 m ol/L PB溶液中,直至標(biāo)本沉入瓶底。行冰凍切片,取大腦冠狀面,厚度為20μm,取含有紋狀體和SNC的切片,保存于0.01 m ol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)中。對免疫熒光,酪氨酸羥化酶(TH),髓鞘堿性蛋白(MBP),cd11b和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)作為一抗。根據(jù)不同目的采用針對性的熒光標(biāo)記二抗,如異硫氰酸熒光素(FITC)或Cy3標(biāo)記的抗兔,大鼠的二抗。凝集素(lectin-FITC)直接與切片孵育(1∶2000,4℃過夜)。以激光共聚焦(德國Leica公司)采集圖像后,利用Bitp lane公司的imaris 5.0軟件對圖像進(jìn)行三維重建,然后分別對紅色和綠色通道上的圖像進(jìn)行處理,構(gòu)建isasurface,并拼合圖像。

2 實驗結(jié)果

2.1 黑質(zhì)致密部小膠質(zhì)細(xì)胞與多巴胺神經(jīng)元的空間關(guān)系

熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),黑質(zhì)致密部中腦腦片可見典型的多巴胺神經(jīng)元形態(tài),胞體較大,約15～25 μm,胞漿和軸突著色(圖1A);小膠質(zhì)細(xì)胞則呈典型的靜息狀態(tài),胞體很小,突起纖細(xì)有多級纖細(xì)分支(圖1B)。兩個同視野圖像重合后可觀察二者的位置關(guān)系(圖1C),由于圖像為二維,無法識別二者是否有直接接觸。因此對圖像進(jìn)行數(shù)字放大,選取一個包括4個多巴胺神經(jīng)元胞體和3個小膠質(zhì)細(xì)胞胞體(圖1D)的典型視野,采用常規(guī)方法觀察三維位置關(guān)系,即用圖像分析軟件中的切片功能,可以對任意點進(jìn)行深度分析,在z軸(此處定義為深度軸)觀察物體之間的關(guān)系。在所選的層面上,均有小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的直接接觸(圖1E)。三維重建后,小膠質(zhì)細(xì)胞的突起直接接觸多巴胺神經(jīng)元表面,而且接觸點非常常見(圖1F)。

2.2 紋狀體小膠質(zhì)細(xì)胞與少突膠質(zhì)細(xì)胞的位置關(guān)系

利用同樣的重建方法,觀察了紋狀體內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞和其他類型膠質(zhì)細(xì)胞的關(guān)系。首先以抗M BP抗體對紋狀體內(nèi)的髓鞘進(jìn)行染色,以顯示少突膠質(zhì)細(xì)胞及其突起,同時染色cd11b,觀察小膠質(zhì)細(xì)胞與之的位置關(guān)系。首先在冠狀面切片上,圖2A為重建之前的圖像,圖2B為對紅色通道重建的圖像,顯示小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)和分布,圖2C為對兩個通道重建并拼合的圖像?？梢娝枨时砻娣植贾芗男∧z質(zhì)細(xì)胞,小膠質(zhì)細(xì)胞突起環(huán)繞髓鞘束,并游走于髓鞘纖維之間,與之保持著密切接觸。在白質(zhì)纖維矢狀面切面的腦片上,同樣可以觀察到同樣的情況。圖2D為未重建之前的圖像,圖2E為對紅色通道進(jìn)行重建的圖像,圖2F為對紅色和綠色重建并拼合后的圖像。共聚焦圖像上觀察到單個小膠質(zhì)細(xì)胞突起形成的閉合圓環(huán)(圖2G箭頭所示),在重建的圖像中也可以看到(見圖2E同樣位置)。為鑒定是否此環(huán)路來自單個小膠質(zhì)細(xì)胞,對這一區(qū)域進(jìn)行三維重建,發(fā)現(xiàn)隨著改變觀察角度(圖2H為45度角,圖2I為15度角),可以清楚地辨別出這并非是同一小膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成的突起環(huán)路,而是來自不同小膠質(zhì)細(xì)胞的突起互相重疊造成的。以GFAP對星形膠質(zhì)細(xì)胞免疫熒光染色與cd11b雙標(biāo)后重建,也可發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞間的緊密聯(lián)系(圖2J～2L)。靜息狀態(tài)下,小膠質(zhì)細(xì)胞有多級分支,環(huán)繞星形膠質(zhì)細(xì)胞的胞體;星形膠質(zhì)細(xì)胞呈梭形,突起細(xì)長,細(xì)胞核較小(圖2L)。

圖1 小膠質(zhì)細(xì)胞與多巴胺神經(jīng)元的位置關(guān)系Fig.1 The relationship between m icrog lia and dopam inergic neuron

2.3 小膠質(zhì)細(xì)胞活化對其他細(xì)胞類型的影響

秋水仙素紋狀體內(nèi)注射1周后,小膠質(zhì)細(xì)胞體現(xiàn)典型的活化形態(tài)(圖3)：去分支化,呈橢圓形,細(xì)胞核與胞體變大,轉(zhuǎn)化為腦內(nèi)的吞噬細(xì)胞-阿米巴狀細(xì)胞,提示其活躍的吞噬行為。免疫熒光染色發(fā)現(xiàn),較多小膠質(zhì)細(xì)胞包裹髓鞘,并將其囊括入胞體(圖3B,3C),髓鞘及纖維隨之逐漸解體。抗GFAP抗體同時免疫熒光染色星形膠質(zhì)細(xì)胞,也發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞活化的形態(tài)(圖3E,3F),伴隨星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生,胞體變圓變大,突起縮短,數(shù)量增加(圖3E,3F)?；罨蟮男切文z質(zhì)細(xì)胞的突起投射到小膠質(zhì)細(xì)胞(圖3E＇,3F＇),而且包繞其胞體(圖3E黑色箭頭所示)。推測星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)增生后可能發(fā)揮了炎癥調(diào)節(jié)功能,與活化小膠質(zhì)細(xì)胞相似,作為腦內(nèi)的免疫細(xì)胞成分發(fā)揮作用。為進(jìn)一步研究小膠質(zhì)細(xì)胞與周圍細(xì)胞的關(guān)系,采用4個熒光通道同時標(biāo)記,即以lectin-FITC染色毛細(xì)血管和小膠質(zhì)細(xì)胞,紅色(羅丹寧或cy3)染色星形膠質(zhì)細(xì)胞,以cy5標(biāo)記的二抗染色多巴胺神經(jīng)元,最后以Hoechst染色所有細(xì)胞核,共標(biāo)結(jié)果顯示這是可行的(圖3G)。

圖2 小膠質(zhì)細(xì)胞與髓鞘細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的空間位置關(guān)系Fig.2 The relationship of spatiallocation between microglia,myeloclast and astrocyte

圖3 小膠質(zhì)細(xì)胞活化后與髓鞘細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的關(guān)系Fig.3 The relationship bet ween microglia,myeloclastand astrocyte after activation

3 討論

在熒光顯微鏡下所采集圖像提供的均為二維信息,只能用于觀察二者是否有共定位,而很難分析觀察目標(biāo)三維空間的位置關(guān)系。激光共聚焦則可通過斷層掃描的方法對切片進(jìn)行逐層掃描,獲得不同層面的二維信息,使對切片進(jìn)行三維重建成為可能。Bitplane的Imaris系列模塊是生命科學(xué)領(lǐng)域中的顯微圖像分析中,多維圖像處理和分析的主導(dǎo)軟件,是目前最方便的三維細(xì)胞結(jié)構(gòu)生物顯微影像分析處理軟件[7]。對切片進(jìn)行分層,分通道掃描后,可以直接導(dǎo)入imaris軟件,進(jìn)行圖像分析。我們主要利用其三維成像的功能觀察小膠質(zhì)細(xì)胞與中樞神經(jīng)系統(tǒng)其他細(xì)胞類型的位置關(guān)系。

小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)抵抗炎癥的第一道防線,負(fù)責(zé)清除死亡細(xì)胞,并在遇到危險信號的時候,招募T細(xì)胞,表達(dá)免疫球蛋白分子和補(bǔ)體受體,其突起處于動態(tài)變化中,不斷對環(huán)境進(jìn)行檢測,為大腦提供了一道有效的預(yù)警系統(tǒng)[8,9]。我們的研究結(jié)果與此一致：在靜息狀態(tài)下,小膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元、髓鞘和星形膠質(zhì)細(xì)胞有緊密的、直接的接觸。但我們的結(jié)果對小膠質(zhì)細(xì)胞與其他細(xì)胞的聯(lián)系提供了更加詳細(xì)、精確和直觀的描述,這為研究不同神經(jīng)元對炎癥易感性,不同疾病或損傷狀態(tài)下小膠質(zhì)細(xì)胞的不同功能,以及腦內(nèi)不同結(jié)構(gòu)小膠質(zhì)細(xì)胞密度提供了新的手段和視角。

眾多證據(jù)提示星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞互相影響,以協(xié)同的方式處理來自外界和內(nèi)環(huán)境中的信息。有關(guān)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞相互作用,在AD中體現(xiàn)得尤為明顯。在AD病變中,小膠質(zhì)細(xì)胞在老年斑中富集,周圍同樣有很多星形膠質(zhì)細(xì)胞。小膠質(zhì)細(xì)胞對損傷因素非常敏感,通過釋放細(xì)胞因子(如IL-1beta,TGF-beta,TNF-α),有毒物質(zhì)或增加吞噬功能,來維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。由于小膠質(zhì)細(xì)胞自身表達(dá)這些細(xì)胞因子的受體,而星形膠質(zhì)細(xì)胞在細(xì)胞因子刺激下,也表達(dá)一些細(xì)胞因子,如集落刺激因子[10],促進(jìn)其增生,這樣小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞通過細(xì)胞因子進(jìn)行交流,形成膠質(zhì)細(xì)胞自分泌或旁分泌的調(diào)節(jié)模式[11]。Shih等[13]的研究支持這個觀點,他們發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基能夠顯著降低小膠質(zhì)細(xì)胞對氧化應(yīng)激的反應(yīng),其機(jī)制是星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基通過活化小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子N rf2,促進(jìn)抗氧化應(yīng)激基因的表達(dá),從而降低氧化自由基的產(chǎn)生。這個調(diào)節(jié)途徑作為一個反饋抑制來防止小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生過多氧化自由基,從而減少對神經(jīng)元的非特異損傷[12,13]。

雖然以上的證據(jù)都表明星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞之間存在信息的交流,但都沒有關(guān)注二者之間相互影響的具體過程和方式,僅認(rèn)為通過旁分泌的方式相互影響。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的局部組織,各種類型的細(xì)胞空間位置需要嚴(yán)格按照其結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行排列,即便作為分泌細(xì)胞的膠質(zhì)細(xì)胞,其空間位置關(guān)系必定與其功能緊密相關(guān)。我們?nèi)S重建的圖像提示二者之間的密切接觸很可能是其發(fā)揮功能的活躍部位。如果某些信息需要星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞直接接觸才能傳遞,這種信息傳遞的結(jié)構(gòu)就非常類似于突觸(神經(jīng)突觸、免疫突觸)?；谶@些信息,我們很粗略地提出一個假說：星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞之間信息交流可能由一種我們稱之為膠質(zhì)突觸(interglial synapse)的結(jié)構(gòu)來介導(dǎo)(圖4),作為一種特化的結(jié)構(gòu),介導(dǎo)不同功能狀態(tài)下二者的信息交流。但必須承認(rèn),這個觀點仍是一個比較初步的假說,需要進(jìn)一步的形態(tài)學(xué)和功能實驗證據(jù)予以證實。

總之,我們的研究證實了激光共聚焦逐層掃描和三維成像技術(shù)結(jié)合的巨大優(yōu)勢,通過三維成像能更加清晰和準(zhǔn)確的把握組織中各種細(xì)胞間的空間位置關(guān)系,尤其對于神經(jīng)系統(tǒng),這種空間位置關(guān)系高度有序的結(jié)構(gòu),更適合用三維成像技術(shù)來研究其微觀結(jié)構(gòu)。雖然我們只采用兩個顏色通道進(jìn)行重建,但四個通道是完全可行的,甚至可以實現(xiàn)5～6個不同的熒光染料的同時染色。在這方面的探索有助于更加全面的分析組織中的細(xì)胞構(gòu)成,相互聯(lián)系和功能。免疫熒光、共聚焦顯微鏡和三維重建技術(shù),極大擴(kuò)展了組織學(xué)研究的領(lǐng)域[14],實際上,這些技術(shù)實現(xiàn)了組織學(xué)和解剖學(xué)的結(jié)合,利用組織學(xué)技術(shù)在微觀尺度上對神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行解剖,其應(yīng)用前途非常廣闊。

圖4 提出的假說Fig.4 Proposed hypotheses

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