張艷玲,李淑蓉,梁亞杰,郭強(qiáng),文燦,蘇炳銀＊

(1.第三軍醫(yī)大學(xué)附屬西南醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,重慶 400038;2.成都醫(yī)學(xué)院發(fā)育與再生四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室,成都 610083;3.第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部神經(jīng)生物學(xué)教研室,重慶 400038)

帕金森病(Parkinson disease,PD)是以黑質(zhì)致密帶腹外側(cè)部(area 9,A 9)多巴胺神經(jīng)元損害最重為特點(diǎn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性性疾病。其腹內(nèi)側(cè)部(area 10,A 10)多巴胺神經(jīng)元損害程度較輕。目前用于解釋選擇性的多巴胺神經(jīng)元損害的學(xué)說有氧化應(yīng)激學(xué)說、興奮性毒性學(xué)說、鈣的細(xì)胞毒作用學(xué)說以及A 9區(qū)特異蛋白的表達(dá)等。近些年來,與特異性損害相關(guān)的抗體介導(dǎo)的體液免疫在PD發(fā)病中的研究屢有報(bào)道。研究認(rèn)為,外周血及腦脊液內(nèi)存在抗多巴胺(DA)能神經(jīng)元的自身抗體[1-3],參與PD的發(fā)病過程。但是,目前尚未能分離出該自身抗體,自身抗體所針對的抗原亦不明確。本研究利用MPTP導(dǎo)致的PD模型,利用免疫組織化學(xué)、酶鏈免疫吸附測定(ELISA)、蛋白免疫印跡法(Western blot)等方法探討該P(yáng)D模型有無自身抗體的存在,并初步推斷自身抗體是否參與PD發(fā)病過程。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物分組及模型制作

雄性C57BL/6小鼠野生型(widetype,W T),體重20～25 g,由第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。采用MPTP亞急性模型：使用Sigma公司的MPTP,使用前用生理鹽水新鮮配制,腹腔注射,注射劑量30mg/(kg?d)連續(xù)5 d。對照組給予腹腔注射相同體積生理鹽水。

1.2 標(biāo)本采集及處理

完成MPTP腹腔注射后次日為d1,之后為d2、d3……依次類推。造模后10 d(d10),動(dòng)物麻醉后,采用摘除眼球的方法取不抗凝血,1～2m l,4℃下凝固12 h,3000 r/min離心5 min,取上清液,即為所需要的血清,于-20℃下保存。

取血后采用頸椎脫臼法處死動(dòng)物,在4℃冰上操作,迅速斷頭取腦。采用以下方式處理：(1)分離黑質(zhì)標(biāo)本,在4℃Zamboni＇s液中浸泡固定24 h后轉(zhuǎn)移到30%蔗糖/Zamboni＇s液中脫水2～3 d,腦片沉到液體底部提示脫水完全,至恒冷冰凍切片機(jī)做連續(xù)切片。(2)每只小鼠的黑質(zhì)標(biāo)本,在體視顯微鏡下盡量去除黑質(zhì)外的部分,使每只小鼠的黑質(zhì)凈重在30 mg左右,按照每10 m g組織加入100μl PRO-PREPTM Solution,在微量勻漿器中勻漿。使用注射器反復(fù)抽吸幾次可增加細(xì)胞溶解,之后在冰盒或者-20℃的冰箱內(nèi)孵育30 min;之后14000 r/min(4℃)離心20 min,轉(zhuǎn)移上清液至新的EP管內(nèi),-20℃保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)方案

利用免疫組織化學(xué)方法觀察黑質(zhì)冰凍切片與自體血清的反應(yīng)情況,以期對體液免疫反應(yīng)部位進(jìn)行形態(tài)學(xué)細(xì)胞定位;利用ELISA觀察黑質(zhì)蛋白質(zhì)勻漿與自體血清的反應(yīng)情況,從蛋白水平驗(yàn)證自體血清中自身抗體的存在;利用Western blot嘗試尋找黑質(zhì)蛋白質(zhì)勻漿中不同蛋白質(zhì)與自體血清的結(jié)合情況,初步尋找自身抗體的靶抗原。

2 結(jié)果

2.1 MPTP注射后PD模型小鼠血清與黑質(zhì)切片的免疫組織化學(xué)研究

2.1.1 PBST的陰性對照 方法：小鼠黑質(zhì)的冠狀切片,一抗為PBST,二抗為生物素化馬抗小鼠,三抗為鏈酶卵白素標(biāo)記的HRP,DAB顯色。

結(jié)果：小鼠黑質(zhì)冠狀切片上有血管著色(圖1)。

圖1 黑質(zhì)自體血清的免疫組化之PBST陰性對照Fig.1 Immunoenzymatic histochem istry staining w ith PBST negative control in SNpc section

圖3 黑質(zhì)自體血清的免疫組化之異常血清結(jié)果Fig.3 Immunoenzymatic histochemistry staining with serum from MPTPm ice in SNpc section

圖2 黑質(zhì)自體血清的免疫組化之正常血清對照Fig.2 Immunoenzymatic histochemistry staining with normal serum control in SNpc section

表1 自體血清和黑質(zhì)蛋白勻漿相互作用的ELISA研究結(jié)果Tab.1 The interactive results of ELISA between serum and protein from substantia nigra

表2 自體血清和黑質(zhì)蛋白勻漿相互作用的ELISA研究結(jié)果Tab.2 The interactive resultsof ELISA between serum and protein from substantia nigra

2.1.2 正常小鼠血清的對照 方法：小鼠黑質(zhì)的冠狀切片(分別選擇正常小鼠和MPTP小鼠的黑質(zhì)切片),一抗為正常小鼠血清,二抗為生物素化馬抗小鼠,三抗為鏈酶卵白素標(biāo)記的HRP,DAB顯色。

結(jié)果：小鼠黑質(zhì)的冠狀切片上,有非特異性的彌漫性著色,皮層及腦干內(nèi)神經(jīng)元均可著色,但黑質(zhì)區(qū)無明顯陽性神經(jīng)細(xì)胞(圖2)。

2.1.3 MPTP造模的PD小鼠血清的免疫組化方法：小鼠黑質(zhì)的冠狀切片(分別選擇正常小鼠和MPTP小鼠的黑質(zhì)切片),一抗為MPTP造模的PD小鼠血清,二抗為生物素化馬抗小鼠,三抗為鏈酶卵白素標(biāo)記的HRP,DAB顯色。

結(jié)果：除與正常小鼠血清相似的彌漫性著色外,正常腦和MPTP小鼠腦黑質(zhì)的冠狀切片上,有可疑的黑質(zhì)陽性神經(jīng)元(圖3)。

2.2 MPTP注射后PD病小鼠血清與黑質(zhì)勻漿的ELISA研究

設(shè)立嚴(yán)格的陰性對照和陽性對照,結(jié)果舉例如下(表1,2)：

例1：提示：(1)包被效果好;(2)陰性及陽性對照結(jié)果均較理想;(3)正常血清與黑質(zhì)勻漿的結(jié)合性與PBST接近,提示結(jié)合力較低;(4)異常血清和正常黑質(zhì)及異常黑質(zhì)的結(jié)合均較強(qiáng),考慮是異常血清中的IgG的Fab段與黑質(zhì)中的抗原有特異性的結(jié)合作用的可能。

例2：結(jié)果與例1相似,且差異表現(xiàn)更加明顯,因此我們認(rèn)為異常血清和正常黑質(zhì)及異常黑質(zhì)的結(jié)合均較強(qiáng),考慮是異常血清小的IgG的Fab段與黑質(zhì)中的抗原有特異性的結(jié)合作用的可能。

2.3 MPTP注射后PD模型小鼠血清與黑質(zhì)勻漿相互作用的Western blot研究

預(yù)染M arker顯色較好,條帶清晰。陰性對照(PBST作為一抗),可見到多個(gè)小細(xì)條帶,考慮為黑質(zhì)中含有生物素的蛋白的非特異性的著色。正常血清與正常腦和異常腦相互作用時(shí),均無明顯著色。異常血清與正常腦蛋白勻漿(泳道1)和異常腦蛋白勻漿(泳道2)相互作用時(shí),在相對分子質(zhì)量為35×103處有弱陽性蛋白著色條帶,提示腦黑質(zhì)勻漿中可能有相對分子質(zhì)量為35×103的蛋白,和患病血清中的抗體結(jié)合(圖4)。

3 討論

本研究中,各種研究方法(免疫組化,ELISA,Western blot)均提示MPTP導(dǎo)致的小鼠亞急性PD模型的外周血中,可能存在與黑質(zhì)蛋白成分有特異性結(jié)合的抗體。

圖4 Western b lot結(jié)果Fig.4 Results ofW estern blot

3.1 自身抗體與PD發(fā)病關(guān)系的研究現(xiàn)狀

自身抗體和PD的關(guān)系一直是有爭議的話題。自1971年左右已經(jīng)有研究關(guān)注到PD患者存在體液免疫的改變[4]。Abramsky等[5]研究認(rèn)為PD中存在針對DA受體的自身免疫反應(yīng),可能是一種抗體樣的物質(zhì)阻斷了受體,從而參與了PD的發(fā)病過程。1980年的一項(xiàng)研究中認(rèn)為PD患者血液中存在有針對交感神經(jīng)元的自身抗體[6]。1例PD男性患者的個(gè)案報(bào)道中,研究發(fā)現(xiàn)患者存在IgM免疫球蛋白病(IgM gammopathy),患者的血清對腦蛋白具有抗體活性,通過Western blot發(fā)現(xiàn)患者血清中有抗體和來自黑質(zhì)相對分子質(zhì)量為156×103的蛋白反應(yīng),也可以和來自大腦皮層灰質(zhì)、小腦皮層、殼核、丘腦或蒼白球的相對分子質(zhì)量為130×103的蛋白反應(yīng)[7]。Carvey等[8]在PD移植治療的研究中認(rèn)為,紋狀體移植腎上腺髓質(zhì)后,可能在紋狀體源性的DA能神經(jīng)元營養(yǎng)因子的作用下,使有爭議的抗DA能自身抗體減少。研究者在培養(yǎng)的黑質(zhì)DA神經(jīng)元中,同樣證實(shí)了PD患者腦脊液中的IgG可攻擊DA神經(jīng)元,移植治療可減輕攻擊情況[9]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)Sj?gren＇s綜合征(CNS-SS)中,患者表現(xiàn)的PD樣癥狀可能與抗心磷脂抗體有關(guān)[10]。

1998年研究者[11]使用特異性抗原的電泳免疫測定的方法(antigen-specific EIAs),測定了神經(jīng)微絲重亞基(neurofilament heavy subunit)、微管蛋白(tubulin)、神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、S100蛋白、tau蛋白、beta淀粉樣肽(beta-am yloid peptide)、髓磷脂堿性蛋白(myelin basic protein,MBP)和硫酸類肝素蛋白多糖(heparan su lfate p roteog lycan)。研究發(fā)現(xiàn)PD患者的血清和腦脊液中出現(xiàn)微管蛋白自身抗體的幾率增加,但沒有發(fā)現(xiàn)其它的自身抗體的幾率增加。2001年協(xié)和醫(yī)院的一項(xiàng)研究認(rèn)為,PD患者中存在自身抗體,能加重PD病情的進(jìn)展[12]。2006年在一例EB病毒性腦炎伴隨PD癥狀的患者中,發(fā)現(xiàn)患者體內(nèi)有自身抗體,可以和人神經(jīng)母細(xì)胞瘤的細(xì)胞株表達(dá)的大約130×103的抗原反應(yīng)[13]。2006年利用Western blot研究發(fā)現(xiàn)PD患者血清和黑質(zhì)蛋白有相互作用[14]。2007年最近的報(bào)道提示遺傳性PD患者血清中有抗alpha-synuclein的自身抗體[15]。2007年另外的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),PD血清中針對胰島素和S100B的自身抗體增加。并且認(rèn)為這種改變和PD進(jìn)展有關(guān)[16]。此外,還有研究認(rèn)為針對鉀通道的自身抗體[17]、針對鈣通道的自身抗體[18]和針對神經(jīng)節(jié)苷脂的自身抗體[19]參與PD的發(fā)病過程。從歷年的研究中我們知道：PD患者血清中的自身抗體是長期被關(guān)注的一個(gè)研究課題,但是該課題一直沒有明確肯定、且能對治療卓有成效的結(jié)論。因此研究結(jié)論也是備受爭議的。但是從眾多的研究中,研究者還是確信有一種自身抗體可能參與了黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元的損傷過程。因此我們認(rèn)為,鑒定該抗體及抗原,可能對延緩PD疾病的進(jìn)程起一定作用。

3.2 本研究結(jié)果提示,PD小鼠血清中可能存在自身抗體,但未能成功分離黑質(zhì)抗原,原因是什么?能怎樣改進(jìn)?

本實(shí)驗(yàn)中,我們使用最基本的研究方法,初步探討了PD動(dòng)物模型和PD患者血清中是否有針對黑質(zhì)蛋白勻漿的自身抗體的問題。實(shí)驗(yàn)中設(shè)立了較嚴(yán)格的陰性和陽性對照,因此可以從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中初步總結(jié)：可能有一種自身抗體能夠和黑質(zhì)的蛋白成分反應(yīng)。該自身抗體的靶蛋白在黑質(zhì),并且可能在神經(jīng)元上,有一相對分子質(zhì)量35×103的黑質(zhì)蛋白可能和自身抗體結(jié)合,可能是尋找中的靶蛋白。

但是遺憾的是,我們沒有能夠鑒定出靶蛋白。原因如下：①結(jié)果背景和陽性結(jié)果間差異不夠顯著,是結(jié)論的肯定性不夠高;②與報(bào)道中不同,本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的陽性條帶分子質(zhì)量均較低,和文獻(xiàn)報(bào)道的有差異,考慮是我們選擇電泳的體系受限制,本實(shí)驗(yàn)體系對大分子量的蛋白分離不佳,結(jié)果可能具有片面性。

進(jìn)一步研究本課題方向,可能有以下方面可以改進(jìn)：(1)抗體角度：血清中因?yàn)榈鞍踪|(zhì)種類繁多,可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)中背景信號增高,和陽性結(jié)果的差異減小,從而可能影響結(jié)果的判讀。因此以后的實(shí)驗(yàn)中,可以首先分離血清中的免疫球蛋白,然后分別作為抗體去嘗試使用,可能在一定程度能提高陽性結(jié)果的判斷;另外,也可以選用腦脊液的免疫球蛋白同時(shí)對照研究,可能能使實(shí)驗(yàn)更加嚴(yán)格。也可以借助其它實(shí)驗(yàn)中使用的方法,從已知蛋白中去分析,尋找PD患者中可能的自身抗體。(2)抗原角度：以往研究者也曾經(jīng)報(bào)道,抗體是多樣的。因此,我們在尋找黑質(zhì)抗原的過程中,一個(gè)比較單純的抗原體系也是尤其重要的。

本研究因?yàn)槭浅醪教接?使用的是涵蓋面很廣的黑質(zhì)蛋白勻漿,其中包括的成分較多。因此本研究結(jié)果,只能體現(xiàn)PD的自身抗體能對黑質(zhì)成分有反應(yīng),但不能說明該抗原是來源于哪些種類的細(xì)胞。因此,如果能夠?qū)⒖乖w系分類純化,可能有利于深入的研究。我們認(rèn)為,將抗原分類純化的方法有以下幾種：(1)將黑質(zhì)在解剖鏡下分離后,進(jìn)行急性神經(jīng)元分離的步驟,是黑質(zhì)神經(jīng)元在保持活性的狀態(tài)下,進(jìn)行快速免疫熒光染色。使用不同的抗體,可以分離出A 9區(qū)和A 10區(qū)多巴胺神經(jīng)元。通過流式細(xì)胞儀可以將兩類多巴胺神經(jīng)元分離并純化。因此我們可以得到純的A 9區(qū)和A 10區(qū)多巴胺神經(jīng)元。再分別進(jìn)行蛋白勻漿,備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。(2)黑質(zhì)神經(jīng)元的培養(yǎng),目前已經(jīng)有培養(yǎng)黑質(zhì)神經(jīng)元的成熟方法。在合適的培養(yǎng)體系下,可以得到純度較高的黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元,可以達(dá)到一定的純化抗原的目的。(3)激光捕獲顯微分離A 9,A 10區(qū)DA能神經(jīng)元：該方法是保持抗原狀態(tài)的最好的方法,但是目前國內(nèi)使用和開展尚少,還需要再進(jìn)一步摸索這種方法在研究本課題的適用性。

4 結(jié)論

亞急性MPTP小鼠的帕金森病模型及PD患者中,外周血中可能存在針對黑質(zhì)結(jié)構(gòu)的自身抗體。PD的自身抗體可能能與黑質(zhì)中相對分子質(zhì)量為35×103的蛋白質(zhì)有反應(yīng)。

[1] He Y,LeWD,Appel SH.Role of Fcgamma receptors in nig ral cell inju ry indu ced by Parkinson disease immunoglobu lin injection into mouse substantia nigra[J].Exp Neu rol,2002,176(2)：322-327.

[2] Fiszer U.Does Parkinson＇s disease have an immunologicalbasis?The evidence and its therapeu tic implications[J].Bio Drugs,2001,15(6)：351-355.

[3] Chen S,Le Wi,Xie W J,et al.Experim en tal destruction of substantia nig ra initiated by Parkinson disease immunoglobulins[J].A rch Neu rol,1998,55(8)：1075-1080.

[4] Henry RE,Goldberg ls,Stu rgyeon P,et al.Serologic abnorm alities associated w ith L-dopa therapy.Vox Sang,1971,20(4)：306-316.

[5] Abram sky O,Litvin Y.Autom immune response to dopam inereceptor as a possible mechanism in the pathogenesis of Parkinson＇s disease and schizoph renia[J].Perspect Biol M ed,1978,22(1)：104-114.

[6] Emile J,Poup lard A,Bossu Van Nieuwenhuyes C,et al.Parkinson＇s disease,dysautonomy,and auto-antibodies directed against sympatheticneu rones(author＇s transl)[J].Rev Neurol(Paris),1980,136(3)：221-233.

[7] Tanaka K,Nakajim a T,A tsum i T,et al.Serum an tibodies to brain proteins in a patient with parkinsonism associated with IgM paraproteinemia[J].Jpn JMed,1988,27(3)：300-304.

[8] Carvey PM,McRae A,Ptak LR,et al.Disappearance of a putative DA-neuron an tibody following adrenal medulla transplantation：relationship to a striatal-derived DA neuron trophic factor[J].Prog Brain Res,1990,82：693-697.

[9] Dahlstr?m A,Wigander A,Lundm ark K,et al.Investigations on auto-antibodies in Alzheimer＇s and Parkinson＇s diseases,using defined neuronal cultures[J].J Neural Transm Suppl,1990,29：195-206.

[10] Mochizuki H,Okauo M,Masaki T,et al.A case of Sjogren＇s syndrome with a high titer of anticardiolipin antibody that developed as parkinsonism[J].Rinsho Shinkeigaku,1997,37(1)：57-59.

[11] Terryberry JW,Thor G,Peter JB.Autoan tibodies in neurodegenerative diseases：antigen-specific frequencies and in trathecalanalysis[J].Neurobiol Aging,1998,19(3)：205-216.

[12] Chen J,Cao X,Xu Y,et al.Experimentalstudy of serum substantia nigra neuron autoan tibody and its effect in Parkinson disease patients[J].J Tongji Med Univ,2001,21(4)：280-282.

[13] Roselli F,Russo I,Fraddosio A,et al.Reversible Parkinsonian syndrome associated with anti-neu ronal an tibodies in acute EBV encephalitis：a case report[J].Parkinsonism Relat Disord,2006,12(4)：257-260.

[14] Huber VC,Mondal T,Factor SA,et al.Serum antibodies from Parkinson＇s disease patients react with neuronal membrane proteins from amouse dopaminergic cell line and affect its dopamine expression[J].JNeu roinflamm ation,2006,3：1.[15] Papachroni KK,Ninkina N,Papapanagiotou A,et al.Autoantibodies to alpha-synuclein in inherited Parkinson＇s disease[J].JNeurochem,2007,101(3)：749-756.

[16] Wilhelm KR,Yanamandra K,Graden M A,et al.Immune reactivity towards insulin,its a my loid and protein S100B in blood sera of Parkinson＇s disease patients[J].Eur J Neurol,2007,14(3)：327-334.

[17] Vincent A,Buckley C,Schott JM,et al.Potassium channel antibody-associated encephalopathy：a potentially immunotherapy-responsive fo rm of limbic encephalitis.Brain,2004,127(Pt 3)：701-712.

[18] AppelSH,Smith RG,Alexianu M,et al.Neurodegenerative disease：autoimmunity involving calcium channels[J].Ann N Y Acad Sci,1994,747：183-194.

[19] Zappia M,Crescibene L,Bosco D,et al.Anti-GM 1 ganglioside antibodies in Parkinson＇s disease[J].Acta Neurol Scand,2002,106(1)：54-57.