原紅艷 張淑香 李興啟 李樹(shù)華

細(xì)胞凋亡是內(nèi)耳感覺(jué)上皮毛細(xì)胞的一種重要損傷方式。以往有學(xué)者通過(guò)在體的噪聲性聾、順鉑及氨基糖苷類(lèi)抗生素等藥物性聾等實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ烷g接推測(cè)氧自由基可誘導(dǎo)毛細(xì)胞凋亡[1,2]，但利用氧自由基的直接損傷模型觀察細(xì)胞凋亡鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)利用耳蝸體外培養(yǎng)技術(shù)，建立一種離體耳蝸的活性氧(reactive oxygen species,ROS)損傷模型，觀察外源性過(guò)氧化氫(H2O2)直接誘導(dǎo)離體培養(yǎng)大鼠耳蝸Corti器毛細(xì)胞凋亡的規(guī)律。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選用新生1～5 d齡SD大鼠24只(購(gòu)自中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，雌雄不拘，隨機(jī)分為4組，每組6只12耳：①無(wú)血清培養(yǎng)液組(H2O2濃度為零)；②0.05 mmol/L H2O2組；③0.1 mmol/L H2O2組；④0.5 mmol/L H2O2組。

1.2實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1建立新生大鼠耳蝸Corti器體外培養(yǎng)模型系統(tǒng)。將大鼠在-20℃環(huán)境下低溫麻醉3～5分鐘，待皮膚變白、不能活動(dòng)后，浸于75%乙醇中消毒2分鐘后取出；眼科剪斷頭，剪開(kāi)顱骨，去除腦組織，剪下顳骨，置于盛有PBS的培養(yǎng)皿中，在超凈工作臺(tái)的解剖顯微鏡下分離出Corti器，并用尖刀按頂回、中回、底回將其分為3段；將分割好的組織片段移入盛有1 ml無(wú)血清培養(yǎng)液(serum-free medium)的培養(yǎng)皿中，并使其下沉到培養(yǎng)皿底部，最后將培養(yǎng)皿緩慢移入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。整個(gè)解剖過(guò)程必須迅速、準(zhǔn)確，嚴(yán)格無(wú)菌操作。

本實(shí)驗(yàn)所采用的無(wú)血清培養(yǎng)基配方如下：1хDMEM 96.4 ml(Hyclone SH30022-01)、serum-free supplement 1 ml(Sigma I-1884)、20%葡萄糖2.4 ml(Sigma G-2020)、青霉素G 0.2 ml(Sigma P-3414)、谷氨酰胺(glutamine)1 ml(Sigma G-6392)。實(shí)驗(yàn)前需將此培養(yǎng)液放入37℃恒溫箱中預(yù)熱10分鐘。

每日在倒置顯微鏡下觀察Corti器生長(zhǎng)情況，記錄培養(yǎng)液的顏色，培養(yǎng)物的形態(tài)、顏色、光澤、生長(zhǎng)密度及范圍，并攝片。每日觀察后換新的培養(yǎng)液一次，換液后放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.20.05、0.1、0.5 mmol/L H2O2組：解剖步驟及培養(yǎng)步驟均同前，次日換液時(shí)，吸出原培養(yǎng)液，各培養(yǎng)皿中分別加入含0.05、0.1、0.5 mmol/L H2O2的無(wú)血清培養(yǎng)液。

1.2.3AO/PI雙重染色 培養(yǎng)48小時(shí)后，各組均終止培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察攝片后，利用AO/PI雙重染色法進(jìn)行凋亡細(xì)胞檢測(cè)，步驟如下：吸干培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)液，加入含100 mmol/L丫啶橙(acridine orange,AO)及10 mmol/L碘化丙啶(prodium iodine,PI) 的PBS(0.1 mol ，pH6.8)染色15分鐘，染色后用PBS充分浸洗，再以4%多聚甲醛固定15～30分鐘，最后用PBS沖洗，甘油封固。立即在熒光顯微鏡下觀察并攝影(熒光激發(fā)光波長(zhǎng)360±10 nm,發(fā)射光波長(zhǎng)≥500 nm)。在單位長(zhǎng)度的顯微鏡攝影取景框范圍內(nèi)對(duì)耳蝸內(nèi)外毛細(xì)胞分別進(jìn)行計(jì)數(shù)觀察。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)計(jì)算機(jī)統(tǒng)計(jì)軟件State 4.0處理，組間差異采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1顯微鏡下觀察H2O2誘導(dǎo)的耳蝸毛細(xì)胞凋亡的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變 培養(yǎng)48小時(shí)后,無(wú)血清培養(yǎng)液組耳蝸基底膜的毛細(xì)胞保持良好的形態(tài)結(jié)構(gòu),在倒置顯微鏡下可見(jiàn)3排外毛細(xì)胞、1排內(nèi)毛細(xì)胞及支持細(xì)胞，內(nèi)、外毛細(xì)胞排列整齊，無(wú)變性壞死(圖 1)。低濃度H2O2組(0.05、0.1 mmol/L)毛細(xì)胞基本保持原有排列狀態(tài)，部分細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生改變，出現(xiàn)水腫及碎裂(圖2)。0.5 mmol/LH2O2組毛細(xì)胞失去原有排列規(guī)律，結(jié)構(gòu)紊亂，出現(xiàn)部分缺失，細(xì)胞形態(tài)學(xué)亦發(fā)生改變(圖3)。

經(jīng)AO/PI雙重染色后的基底膜，凋亡細(xì)胞被染為橙紅色，而活性細(xì)胞則為亮綠色(圖4～6)。分別計(jì)數(shù)單位長(zhǎng)度基底膜上凋亡毛細(xì)胞數(shù)及毛細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算相應(yīng)的內(nèi)外毛細(xì)胞凋亡率。各組耳蝸毛細(xì)胞凋亡率見(jiàn)表1。各組中支持細(xì)胞均保持良好活性，未見(jiàn)凋亡及缺失(圖1～3)。

2.2耳蝸不同部位毛細(xì)胞的凋亡規(guī)律 耳蝸不同部位毛細(xì)胞凋亡率各不相同，除了0.05 mol/L H2O2組各回內(nèi)毛細(xì)胞無(wú)調(diào)亡外，其余各濃度H2O2組由頂回向底回IHC、OHC的凋亡均逐漸加重，各回中OHC的凋亡均明顯重于IHC，且隨著H2O2濃度增加，各回內(nèi)外毛細(xì)胞凋亡逐漸加重(表1)。

3 討論

研究表明在氨基糖苷類(lèi)抗生素、卡鉑及噪聲引起的耳聾中，均有Corti器毛細(xì)胞的凋亡，而且活性氧自由基在其中起重要作用[3～5]。本研究顯示，不同種類(lèi)細(xì)胞對(duì)H2O2毒性敏感性不同，OHC最敏感，IHC次之，支持細(xì)胞未受到任何影響。與IHC相比，OHC的獨(dú)特結(jié)構(gòu)是其易受ROS攻擊的基礎(chǔ)[6]。耳蝸OHC壁由質(zhì)膜構(gòu)成，通過(guò)膜下池系統(tǒng)與中間的皮板層或細(xì)胞骨架彈性蛋白結(jié)合，其側(cè)面襯以線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的囊泡結(jié)構(gòu)是ROS的產(chǎn)生和受損害的靶[7]。此外,ROS改變了膜的通透性造成細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+增多是ROS造成OHC損傷的另一個(gè)原因。有報(bào)道證明ROS作用于游離的OHC能夠使其細(xì)胞膜上的Ca2+流增多且形態(tài)學(xué)發(fā)生改變，細(xì)胞膜損傷后胞溶性Ca2+在胞內(nèi)積聚也增加，胞內(nèi)Ca2+積聚導(dǎo)致的細(xì)胞毒性作用包括胞內(nèi)構(gòu)架的破壞、DNA斷裂形成碎片、細(xì)胞器如線粒體的損傷[8]。有學(xué)者認(rèn)為ROS的損害機(jī)制是它破壞了肌動(dòng)蛋白微絲、角蛋白中間纖維和微管，還可能是從其拋錨的漿膜上斷離了細(xì)胞骨架蛋白[6]。Clerici等在離體OHC實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)ROS可引起耳蝸OHC突觸前膜囊泡數(shù)量增加和耳蝸OHC的平均長(zhǎng)度縮小，這證明了核膜磷脂的過(guò)氧化作用[8]。而支持細(xì)胞上存在著NO/cGMP途徑,該途徑可對(duì)細(xì)胞內(nèi)的Ca2+升高起到負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用,從而降低支持細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度,阻斷鈣超載引起的細(xì)胞死亡[9]，這可能是支持細(xì)胞不易受ROS攻擊的原因之一。此外，耳蝸各種細(xì)胞中還原型谷胱甘肽(glutathlione,GSH)的含量不同也導(dǎo)致它們對(duì)H2O2敏感性不同，其中OHC中GSH含量很低，故其清除ROS能力弱，損傷最重；而IHC和支持細(xì)胞中GSH含量較高[10]，不易受H2O2毒性損傷。

圖1倒置顯微鏡下觀察無(wú)血清培養(yǎng)液組基底膜(底回) OHC、IHC及支持細(xì)胞均排列整齊，輪廓清晰，活性良好，圖中箭頭所示分別為OHC及IP(內(nèi)柱細(xì)胞)(×200)
圖2 0.05 mmol/L H2O2組毛細(xì)胞(底回) 基本保持原有排列狀態(tài)，但折光性較差 活性欠佳，圖中箭頭所示分別為OHC及IP(內(nèi)柱細(xì)胞)(×200)
圖3 0.5 mmol/L H2O2組基底膜(底回) OHC幾乎全部凋亡，只有少量OHC仍保持活性(箭頭所示)，IHC也部分凋亡，而Deiters細(xì)胞(D)始終保持完好(箭頭所示)(×200)
圖4無(wú)血清培養(yǎng)液組毛細(xì)胞(底回) 排列整齊，形態(tài)正常(箭頭所示)(AO/PI雙重染色)(×100)
圖5 0.05 mmol/L H2O2組(底回) 可見(jiàn)少量毛細(xì)胞凋亡，被PI染為橙紅色(箭頭所示)(AO和PI雙重染色)(×200)
圖6 0.5 mmol/LH2O2組(底回) 可見(jiàn)大量凋亡毛細(xì)胞(箭頭所示)(AO和PI雙重染色)(×200)

表1 不同濃度H2O2誘導(dǎo)的耳蝸不同部位內(nèi)、外毛細(xì)胞的凋亡率

注：*分別與同組中回及頂回內(nèi)毛細(xì)胞凋亡率比較，P<0.05;△分別與其他兩組底回內(nèi)、外毛細(xì)胞凋亡率比較，P<0.05

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示耳蝸不同部位對(duì)H2O2的敏感性也不同，底回?fù)p傷最重，頂回和中回?zé)o明顯差異。Ska等[2]在單離外毛細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程中已發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間延長(zhǎng)，頂回OHC存活率高于底回，且死亡細(xì)胞的形態(tài)特征與凋亡相同，同時(shí)，還檢測(cè)到頂回OHC的GSH水平明顯高于底回。因此提示各回OHC對(duì)凋亡的不同易感性是由于它們清除活性氧的能力不同造成的。

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