萬(wàn)良財(cái) 李琰 謝南屏 李永賀

鼓室硬化(tympanosclerosis)是指中耳黏膜固有層發(fā)生的鈣化病變，系中耳黏膜慢性感染或炎癥的結(jié)果,目前鼓室硬化的發(fā)病機(jī)理還不十分明了。為了解豚鼠鼓室硬化中耳黏膜的超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及進(jìn)一步了解豚鼠鼓室硬化的發(fā)病機(jī)理，本研究對(duì)鼓室硬化造模成功的豚鼠中耳腔不同部位黏膜組織行電鏡觀查，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康雜色豚鼠8只，雌雄不拘，體重為250～350 g，排除外耳道、鼓膜、中耳等感染。其中6只(8耳)行鼓室硬化造模(鼓室硬化組)，2只(4耳)為正常對(duì)照組(對(duì)照組)。

1.2鼓室硬化豚鼠造模方法 受試豚鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(35 mg/kg)施行全身麻醉，安爾碘消毒雙耳及外耳道皮膚，用1 ml無(wú)菌注射器抽取1×108個(gè)/L金黃色葡萄球菌液100 μl，顯微鏡下經(jīng)鼓膜緊張部后下象限向鼓室內(nèi)注射，觀察6個(gè)月以上,觀察期間不行任何治療[1]。造模成功標(biāo)準(zhǔn):顯微鏡下鼓膜穿孔邊緣或鼓室腔可見(jiàn)鈣化斑。

1.3中耳黏膜取材 將鼓室硬化組及對(duì)照組豚鼠分別以1%戊巴比妥鈉(35 mg/kg) 腹腔注射麻醉，往聽(tīng)泡內(nèi)注入2．5%戊二醛1～2 ml，斷頭處死豚鼠，快速取出聽(tīng)泡。使用耳科電鉆磨開(kāi)聽(tīng)泡，顯微鏡下剝?nèi)≈卸謩e取咽鼓管、鼓室、鼓岬、鼓竇、乳突氣房5處黏膜組織。

1.4電鏡標(biāo)本的制備 將固定液及所用容器預(yù)冷后，在1分鐘內(nèi)將所取中耳黏膜組織切成2 mm×2 mm×1 mm大小，浸入2.5﹪戊二醛固定液中固定3小時(shí)(前固定)，經(jīng)0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)漂洗后予2﹪四氧化鋨固定2小時(shí)(后固定)，經(jīng)0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)漂洗；30﹪酒精脫水8分鐘，50﹪酒精脫水8分鐘，70﹪酒精脫水8分鐘，90﹪酒精脫水12分鐘，100﹪酒精脫水3次，每次12分鐘，行梯度脫水；脫水劑:包埋劑=1:1，1小時(shí)；脫水劑:包埋劑=1:2，2小時(shí)；純包埋劑，5小時(shí)；將標(biāo)本轉(zhuǎn)入塑料囊，70 ℃，10小時(shí)，Epon812環(huán)氧樹(shù)脂包埋；超薄切片，面積約0.2～0.3 mm2；予醋酸鈾及檸檬酸鉛染色，在干凈培養(yǎng)皿內(nèi)放置蠟板，把醋酸鈾染液滴在蠟板上，將撈有切片的銅網(wǎng)覆于染液上30分鐘，然后用雙蒸水沖洗﹑吸干。再銅網(wǎng)覆于檸檬酸鉛染液上10分鐘，然后用雙蒸水沖洗﹑吸干后電鏡下觀察。

2 結(jié)果

正常豚鼠中耳黏膜由上皮細(xì)胞及上皮下層組成, 上皮下層結(jié)構(gòu)主要有膠原纖維、纖維細(xì)胞，膠原纖維少,排列較整齊；纖維細(xì)胞形態(tài)大小正常，胞核中染色質(zhì)染色淺且均勻,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體形態(tài)正常,見(jiàn)線粒體嵴，無(wú)溶酶體，上皮層及上皮下層均未見(jiàn)鈣質(zhì)沉著(圖1)。鼓室硬化豚鼠中耳不同部位黏膜均見(jiàn)變性的成纖維細(xì)胞散在分布,成纖維細(xì)胞不規(guī)則變形、伸長(zhǎng)、變性，胞核形狀不規(guī)則，胞核含深染且染色不均勻的染色質(zhì), 異染色質(zhì)常聚集分布于核周邊。在核周的細(xì)胞漿內(nèi)有較多的變性的溶酶體及腫脹的線粒體，線粒體嵴消失，溶酶體染色較線粒體深，線粒體和溶酶體內(nèi)均可見(jiàn)鈣質(zhì)沉著。細(xì)胞漿內(nèi)可見(jiàn)張力絲和內(nèi)質(zhì)網(wǎng),粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)大部分?jǐn)U張成圓球狀或橢圓囊狀,另外，細(xì)胞漿內(nèi)還可見(jiàn)中心體。細(xì)胞基質(zhì)見(jiàn)膠原纖維顯著增生，各個(gè)方向上均可見(jiàn)，交叉成網(wǎng)或互相平行呈半螺旋形排列，其內(nèi)含大量無(wú)定形的富含電子小囊泡，伴或不伴鈣化,有時(shí)可因濃聚而呈現(xiàn)空影(圖2)。

圖1正常豚鼠中耳黏膜電鏡圖纖維細(xì)胞形態(tài)正常,線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)正常,膠原纖維少,未見(jiàn)鈣化(×50 000)(1a)。 胞核染色均勻,胞漿內(nèi)見(jiàn)大量線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng),未見(jiàn)溶酶體及鈣化(×40 000)(1b)
圖2鼓室硬化豚鼠中耳黏膜電鏡圖伸長(zhǎng)退變的纖維細(xì)胞及大量膠原纖維，溶酶體、線粒體、細(xì)胞基質(zhì)小囊泡見(jiàn)鈣化(×15 000)(2a)。大量膠原纖維增生，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張成囊狀,溶酶體、線粒體見(jiàn)鈣化(×25 000)(2b)

3 討論

鼓室硬化是中耳黏膜長(zhǎng)期受慢性炎癥刺激的結(jié)果，目前人的鼓室硬化的研究已較深入，通常認(rèn)為與遺傳因素、高鈣血癥、氧自由基﹑鈣通道異常等因素有關(guān)[2～5]。Wielinga等[6]認(rèn)為鼓室硬化發(fā)生可分為三個(gè)階段，即：黏膜膠原纖維分解、透明斑塊形成、鈣化發(fā)生。人鼓室硬化中耳黏膜電鏡特點(diǎn)已有報(bào)道[7],但鼓室硬化豚鼠中耳黏膜的透射電鏡特點(diǎn)少見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。Mann等[8]認(rèn)為豚鼠中耳黏膜類(lèi)似于人中耳黏膜，由上皮細(xì)胞及上皮下層組成,上皮下層結(jié)構(gòu)主要有膠原纖維、毛細(xì)血管、淋巴管和神經(jīng)，主要的細(xì)胞成分是纖維細(xì)胞，偶爾也可見(jiàn)到肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞。

從文中結(jié)果看，豚鼠鼓室硬化中耳黏膜成纖維細(xì)胞的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)大部分?jǐn)U張成圓球狀或橢圓囊狀,這可能與成纖維細(xì)胞的變性有關(guān)。細(xì)胞基質(zhì)膠原纖維顯著增生，部分區(qū)域電鏡下可呈島狀改變，這可能與該區(qū)域膠原纖維降解破壞有關(guān)，這一特征與人鼓室硬化中耳黏膜透射電鏡特點(diǎn)非常相似[1]。另外與對(duì)照組顯著不同的是鼓室硬化黏膜成纖維細(xì)胞外有脂肪顆粒，在膠原纖維束間大量?jī)?nèi)含無(wú)定形的富含電子小囊泡常位于靠近基底膜的上皮下層。Mann等[8]認(rèn)為小囊泡有部分來(lái)源于溶酶體。在某些特定的情況下，如感染或創(chuàng)傷可導(dǎo)致細(xì)胞鈣離子濃度異常增高而損害細(xì)胞并伴有溶酶體釋放至胞外，而胞外含堿性磷酸酶的小囊泡在鈣化過(guò)程中起重要作用，它是鈣化斑的結(jié)晶中心，鈣化斑是由磷酸鈣結(jié)晶形成的。本研究發(fā)現(xiàn)豚鼠鼓室鈣化可發(fā)生于胞內(nèi)外，胞外通常好發(fā)于細(xì)胞基質(zhì)小囊泡；胞內(nèi)通常發(fā)生于線粒體、溶酶體及脂質(zhì)顆粒內(nèi)的磷脂結(jié)構(gòu)。

鼓室硬化通常是由于中耳結(jié)締組織長(zhǎng)期受炎癥刺激而發(fā)生的營(yíng)養(yǎng)不良性鈣化。陳杰等[9]認(rèn)為細(xì)胞內(nèi)鈣化起始于壞死細(xì)胞的線粒體,當(dāng)細(xì)胞損傷后膜通透性增加,鈣離子內(nèi)流增加，線粒體攝取鈣也增加；而細(xì)胞外鈣化則始于小囊泡內(nèi)來(lái)源于變性細(xì)胞的磷脂,鈣在這些小囊泡內(nèi)通過(guò)同小囊泡膜的磷脂結(jié)合而被濃縮，磷脂經(jīng)磷脂酶降解形成磷酸鹽。損傷和壞死組織中變性的蛋白質(zhì)極易與磷酸鹽離子結(jié)合,再與鈣離子形成磷酸鈣沉淀。另外Mann等[10]通過(guò)用鈣拮抗劑抑制鼓室硬化發(fā)生的實(shí)驗(yàn)研究得出：當(dāng)中耳受炎癥等刺激后,細(xì)胞膜受損，細(xì)胞內(nèi)的三磷酸腺苷池會(huì)耗竭，細(xì)胞鈣超載導(dǎo)致細(xì)胞壞死，結(jié)果細(xì)胞內(nèi)的基質(zhì)小胞會(huì)釋放到細(xì)胞外間隙中成為鈣化形成的中心，細(xì)胞外基質(zhì)小囊胞具有鈣親和力，使之成為上皮下鈣化的結(jié)晶中心。本研究電鏡下所見(jiàn)中耳黏膜鈣化通常發(fā)生的部位也證實(shí)了上述觀點(diǎn)。

本研究結(jié)果顯示，豚鼠鼓室硬化超微結(jié)構(gòu)與人鼓室硬化超微結(jié)構(gòu)極相似，細(xì)胞內(nèi)及胞間基質(zhì)均有鈣化。本研究動(dòng)物模型為研究人鼓室硬化發(fā)病機(jī)理提供了較好的模型。

4 參考文獻(xiàn)

1 李琰，謝南屏，萬(wàn)良財(cái).鼓室注射金葡菌致豚鼠鼓室硬化動(dòng)物模型的建立[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，27:1 784.

2 Koc A, Uneri C. Genetic predisposition for tympanosclerotic degeneration[J]. Eur Arch Otorhinolaryngol， 2002 ，259：180.

3 de Carvalho Leal M， Ferreira Bento R，da Silva Caldas Neto S，et al. Influence of hypercalcemia in the formation of tympanosclerosis[J].Otol Neurotol，2006，27：27.

5 Selcuk A, Akdogan O, Ozcan I, et,al. Topical application of calcium channel blockers to reduce the progression of experimentally induced myringosclerosis and tympanosclerosis[J]. Laryngoscope，2008，118:697.

6 Wielinga EW, Kerr AG.Tympanosclerosis[J]. Clin Otolaryngol, 1993, 18：341.

7 萬(wàn)良財(cái)，郭夢(mèng)和，謝南屏，等.鼓室硬化患者中耳黏膜及硬化灶組織病理學(xué)特點(diǎn)[J].聽(tīng)力學(xué)及言語(yǔ)疾病雜志，2009，17：351.

8 Mann W. Experimental tympanosclerosis following infectionwith Streptococcus pyogenes and vitamin D3 intoxication[J].Arch Otorhinolaryngol，1986，243： 296.

9 陳杰，李甘地.細(xì)胞、組織的損傷[M].見(jiàn):陳杰,主編.病理學(xué).北京：人民衛(wèi)生出版社，2005.22～30.

10 Mann W,Beck C,Schaefer HE.The significance of calcium antagonists in rat experimental tympanosclerosis[J].Arch Otorhinolaryngol，1987,243：382.