楊 輝,王 鴻,鄧澤元,范亞葦,李 靜

(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室,高等研究院,江西南昌 330047)

山蕗菜,中文學名掌葉蜂斗菜 (Petasites tricholobus A.Gray),系菊科蜂斗菜屬植物,廣泛分布于我國西北、西南地區(qū)。山蕗菜原是一種野生蔬菜,食用部分為葉柄,一般于夏、秋季采挖根基,鮮用或曬干。蜂斗菜“苦辛,涼”,可“治扁桃體炎,癰腫療毒,毒蛇咬傷”,“消腫止痛,解毒祛癖,治跌打損傷”[1]。山蕗菜根中除了含有倍半萜內酯、三萜類化合物[2]、粗纖維、揮發(fā)油等以外,還含有豐富的多糖類化合物。人工種植的山蕗菜根須布滿全田,根須每公頃可達 22.5 t左右,有的還達到 30 t以上。因此,作為一種傳統(tǒng)中草藥,山蕗菜根資源開發(fā)利用潛能巨大。

植物采摘后,體內的酶催化作用仍然在繼續(xù),直到酶系的底物耗盡或 pH不再適合反應進行時才終止。這個過程中,酶的活動方向趨向于水解反應,各種成分都會發(fā)生變化。山蕗菜采收后,留在地里的根被水浸過以后,會很快腐爛,其速度比一般植物要快得多,這很可能是由于其自身的酶活力比較高,很容易水解自身物質并被微生物利用所致。本文研究山蕗菜根主要酶的活性,為山蕗菜根的開發(fā)及其酶的資源利用提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 材料

山蕗菜根采自江西九江地區(qū)。經本實驗室測定其蛋白質、多糖和纖維素含量分別為 12.3%、30.4%和 19.9%。

1.1.2 儀器和試劑

722型分光光度計 (上海精密科學儀器有限公司)、AR1140電子分析天平 (美國奧豪斯貿易公司)、Anke TDL-5-A低速大容量離心機 (上海安亭科學儀器廠)、BD-86L低溫冰柜 (青島海爾特種電冰柜有限公司)、KDY-9820凱氏定氮儀 (廈門精藝科技有限公司)、DZT W調溫電熱套 (北京市永光明醫(yī)療儀器廠)、SK3310HP超聲清洗器 (上?？茖С晝x器有限公司)、JYL-350A料理機 (九陽股份有限公司)、PHS-3C型 pH計 (上海精密科學儀器有限公司);無水硫酸銅、氫氧化鈉、硫酸鉀、濃硫酸、硼酸、無水乙醇、葡萄糖、苯酚、重鉻酸鉀、淀粉、硫代硫酸鈉、碘化鉀、醋酸、硝酸、福林試劑、DNS試劑、考馬斯亮藍 (以上試劑均為分析純)。

1.2 實驗方法

1.2.1 蛋白質含量隨時間的變化

把新鮮山蕗菜根勻漿,取 10支離心管,分別加入 2 g勻漿液,在 40℃水浴中分別放置 0、0.5、1.0、1.5、2.16、2.83、3.5、4.5、5.5、7.0 h,立即放在沸水浴中滅酶 10 min,備用。用凱氏定氮儀測定各樣品的蛋白質含量[3],每份做 3個平行。

1.2.2 多糖含量隨時間的變化

取 10支干凈試管,分別加入約 2.5 g勻漿液,在 40℃水浴中分別放置 0、0.5、1.0、1.5、2.16、2.83、3.5、4.5、5.5、7.0 h,立即放在沸水浴滅酶10 min。轉入圓底燒瓶,加 40 mL 80%乙醇 95℃回流 1 h,抽濾,濾渣用 40 mL水提取 2 h[4-5]。抽濾,濾液定容到 100 mL備用。用苯酚 -硫酸法[6]測定多糖含量,用葡萄糖標準溶液繪制標準曲線,得到標準方程:y=6.988 4x-0.011 3,其線性相關系數(shù) R2=0.998 8。

1.2.3 纖維素含量隨時間的變化

取 30支試管,分別加入 1.5 g勻漿液,均分成10組 ,每組在 40℃水浴中分別放置 0、0.5、1.0、1.5、2.16、2.83、3.5、4.5、5.5、7.0 h。按 72%硫酸水解法[7]測定纖維素含量。

1.2.4 酶的粗提及其濃度測定

取 250 g樣品,加磷酸緩沖溶液 (pH值 6.5),搗碎勻漿 (M∶V=1∶1),4層紗布過濾,濾液加硫酸銨至 20%飽和度,加 EDTA和維生素 C各 0.05 g,4℃下過夜,離心去沉淀,上清液加硫酸銨至 85%飽和度,離心得沉淀[8]。取部分沉淀溶于適量水中,用考馬斯亮藍 G-250法[9]測定酶蛋白的含量。

1.2.5 蛋白酶總活力測定

參照福林法[10]測定蛋白酶活力。定義:在測定條件下 1 g粗蛋白 1 min內經酶分解酪蛋白產生1μg酪氨酸表示一個活力單位。計算公式如下:

式中:A1為試樣吸光度;K1為標準曲線斜率;V1為酶水解時的總體積(mL);T1為水解時間 (min);C為根提取液中酶平均濃度μg/mL。

1.2.6 多糖酶總活力測定

用 DNS法[11-12]測定多糖酶活力。定義:在測定條件下 1 g粗多糖 1 min內經酶分解自身多糖產生 1μg葡萄糖為一個活力單位。計算公式如下:

式中:A2為試樣吸光度;K2為標準曲線斜率;V2為酶水解時的總體積(mL);T2為水解時間 (min);C為根提取液中酶平均濃度μg/mL。

2 結果與分析

2.1 蛋白質含量變化

山蕗菜根經勻漿處理,放置不同時間其蛋白氮含量的變化情況見圖1。從圖中可以看出,前 0.5 h蛋白氮含量下降很快,相對含量減少 35%,1 h時減少了 41.58%,此后的 6 h蛋白氮含量下降很少。這表明蛋白酶在前 1 h內活性很高,尤其是前 0.5 h;在 0.5 h～1 h之間,酶活性降低速度較快,隨著時間的延長其活性降至較低。

圖1 蛋白質含量隨時間的變化

2.2 多糖含量變化

山蕗菜根經勻漿處理,放置不同時間其多糖含量的變化情況見圖2。從圖中可以看出,多糖含量在前 2 h內變化比較平穩(wěn),下降較快,相對含量減少26%左右,之后下降很小,3 h左右基本達到穩(wěn)定,此后多糖含量下降很少。這表明在前 2 h內多糖分解酶活性較穩(wěn)定,活力也較大,之后活性降低,3 h后幾乎沒有活性。

圖2 多糖含量隨時間的變化

2.3 纖維素含量變化

山蕗菜根經勻漿處理,放置不同時間其纖維素含量的變化情況見圖3。從圖中可以看出,纖維素含量在前 3 h內變化比較平穩(wěn),下降較慢,此后纖維素含量變化較小,3.5 h后 (相對含量減少 3.8%左右)基本保持不變。這表明山蕗菜根中纖維素酶隨時間的延長活性降低,而且與蛋白酶和多糖分解酶相比活性較低。因此,本文選擇活性較高的蛋白酶和多糖酶為研究對象測定其活性。

圖3 纖維素含量隨時間的變化

綜合圖1、2、3,可知在相同的時間內,蛋白質含量的相對減少量大于多糖,多糖大于纖維素,說明山蕗菜根的蛋白質很容易被自身的酶作用,其次分別為多糖、纖維素。本文通過對蛋白質、多糖和纖維素的含量隨時間的相對變化的研究可知,蛋白質水解程度為 50%左右,多糖約為 26%,纖維素約為3.8%,而且水解速度蛋白質大于多糖和纖維素,由此推出山蕗菜根蛋白酶活力高于多糖酶,纖維素酶的活性則較小。

2.4 酶提取液濃度測定

用牛血清蛋白溶液作標準曲線,得到其標準方程為 y=0.000 4x+0.000 3,線性相關系數(shù) R2=0.994 1。將樣液吸光度折算成酶蛋白濃度,結果見表1,山蕗菜根提取液中酶蛋白平均濃度 (C)為23.83μg/mL。

表1 酶提取液蛋白質含量

2.5 蛋白酶活性測定

用酪氨酸標準溶液繪制標準曲線,其方程為 y=111.00x-24.601,R2=0.999 9,斜率 K1=111.00。把測得的吸光度值 A1、酶水解時的總體積V1(4 mL),水解時間 T1(10 min),根提取液中酶平均濃度 C(23.83μg/mL),代入 (1)式計算蛋白酶活力,得到平均活力為 24 221.57U/g蛋白 (表2)。

表2 蛋白酶活力

2.6 多糖分解酶活性測定

用葡萄糖標準溶液繪制的標準曲線,標準方程為 y=1.135 9x+0.080 5,線性相關系數(shù) R2=0.994 3,斜率 K2=1.135 9。把測得的吸光度值 A2、酶水解時的總體積 V2(5 mL),水解時間 T2(30 min),根提取液中酶平均濃度 C(23.83μg/mL)代入 (2)式計算的多糖酶活力見表3,得到多糖酶平均活力為45 018.65U/g蛋白。

表3 多糖酶活力

3 討 論

本文通過研究山蕗菜根主要物質含量隨時間的變化情況,側面反映其中酶的活性。結果表明山蕗菜根的蛋白質很容易被自身的酶作用,其次分別為多糖,說明山蕗菜根蛋白酶活和多糖酶活性較高。據(jù)種植山蕗菜職工反映,山蕗菜收采后留在地里的根水泡后極易腐爛,這可能與其所含高活性的酶有關。經研究,山蕗菜根中蛋白質、多糖含量分別為12.3%、30.4%,高活性的蛋白酶和多糖酶在適宜的條件下 (溫度和水泡)極易水解蛋白質和多糖。

本文用福林法和 DNS法[11-12]分別測得粗提液蛋白酶和多糖酶活力為 24 221.57 U/g粗蛋白和45 018.65 U/g粗蛋白。但其活性比一些酶制劑要低,方煥等[13]測得木瓜蛋白酶活力在 37℃為 31.2萬 U/g干粉,在最適溫度 80℃時為 54.6萬 U/g干粉,分別為本蛋白酶的 15倍和 23倍。這可能與酶純度有關,因為本實驗使用的是粗酶液;此外酶作用的條件如溫度、反應物濃度、pH、金屬離子等對酶的活性也有較大影響;因此有必要開展山蕗菜根酶的分離純化和酶作用條件的優(yōu)化。

[1] 毋 冰.蜂斗菜 Petasites hybridus L.和旱芹 Apium graveolens L.的化學成分研究[D].沈陽藥科大學碩士學位論文,2007.

[2] Xie W D,Zhang Q,Li Pi,et a1.Two triterpenoids and other constituents from Petasites tricholobus[J].Phytochemistry,2005,66:2340-2345.

[3] 侯曼玲.食品分析 [M].北京:化學工業(yè)出版社,2004:130-131.

[4] 楊惠麟.白毛藤多糖的提取及其藥效學的初步研究[D].湖南農業(yè)大學,2006.

[5] 程 迪,于 潔,董 麗.河南產牡丹皮中多糖含量的測定[J].安徽農業(yè)科學,2008(2):518,528.

[6] 馬猛華,崔 波,于海峰,等.苯酚一硫酸法測定玫瑰花渣中多糖含量的研究[J].山東輕工業(yè)學院報,2008,22(4):23-25.

[7] 熊素敏,左秀鳳,朱永義.稻殼中纖維素、半纖維素和木質素的測定[J].糧食與飼料工業(yè),2005(8):40-41.

[8] 顧昌玲,朱寶成,周艷芬,等.延胡索纖溶酶的分離純化及部分性質[J].中國生化藥物雜志,2008(2):81-84.

[9] 李 娟,張耀庭,曾 偉,等.應用考馬斯亮藍法測定總蛋白含量[J].中國生物制品學雜志,2000(2):118-120.

[10] 鄒建云,林文光.直接測定菠蘿皮汁蛋白酶活性的方法[J].云南熱作科技,1998,21(3):38-39.

[11] 劉德海,楊玉華,張發(fā)旺,等.飼用纖維素酶活力測定方法的探討[J].飼料工業(yè),2002,23(4):34-35.

[12] 佟愛東,黎宇君.達吉膠囊中纖維素酶的活力測定[J].中國生化藥物雜志,2005(5):299-301.

[13] 方 煥,生吉萍,吳顯榮.工業(yè)生產中木瓜蛋白酶的活性檢測方法比較[J].食品與機械,2000(6):27-29.