歐陽(yáng)玉祝,車(chē)少林,黃偉濤

(1.植物資源保護(hù)與利用湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南吉首 416000;2.吉首大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,湖南吉首 416000)

海金沙 (Lygodium japonicum)是一種富含多酚和黃酮類(lèi)化合物的多年野生草質(zhì)藤本植物,具有抗菌消炎、降低血管脆性、抗氧化和抗衰老、清除羥基自由基等功效[1],不僅是一種良好的抗菌藥物,而且是一種優(yōu)良的天然食品抗氧劑。研究表明:合成抗氧劑 BHA、BHT有致癌作用[2],天然抗氧劑對(duì)油脂和含脂食品具有比合成抗氧化劑更強(qiáng)的抗氧化活性和自由基清除能力,這就使天然抗氧劑成為當(dāng)今人們關(guān)注和研究的熱點(diǎn)[3-4]。大孔吸附樹(shù)脂分離技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的分離精制技術(shù),具有化學(xué)穩(wěn)定性高、吸附容量大、選擇性好、吸附速度快、解吸條件溫和、再生處理方便、分離費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn),廣泛用于化工、醫(yī)藥、食品和環(huán)保等領(lǐng)域[5-8]。本實(shí)驗(yàn)用海金沙為原料,用大孔樹(shù)脂吸附法分離總黃酮,研究其分離工藝條件。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器和藥品

1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

UV-2450型紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì) (日本島津公司);KQ-250E型超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司);SHB-III循環(huán)水式多用真空泵 (鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);DF-101S集熱式恒溫磁力攪拌器 (鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);FA2104N分析天平 (上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品

海金沙采自湖南永州,采回的樣本經(jīng)洗凈、晾干、切碎,于 60℃,0.08 MPa真空干燥后,用植物粉碎機(jī)粉碎到 60目,置于干燥器中備用;大孔吸附樹(shù)脂是天津光復(fù)精細(xì)化工研究所生產(chǎn);乙醇,氫氧化鈉,鹽酸,醋酸,亞硝酸鈉,硝酸鋁為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?蘆丁對(duì)照品為中國(guó)藥品生物制品鑒定所生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大孔樹(shù)脂的預(yù)處理

D-101大孔吸附樹(shù)脂按參考文獻(xiàn)[8]進(jìn)行預(yù)處理。

1.2.2 海金沙總黃酮的提取

取 50 g海金沙按參考文獻(xiàn)[9]用超聲波輔助提取法提取總黃酮,提取液定容到 500 mL備用。

1.2.3 總黃酮的分離

取 5.0 g D-101大孔樹(shù)脂于 250 mL錐形瓶中,按一定的固液比加入實(shí)驗(yàn)量的提取液,在一定溫度下吸附,抽濾,樹(shù)脂再用一定濃度的乙醇溶液做解吸劑洗脫黃酮,收集洗脫液于 50 mL容量瓶中定容至刻度,分析總黃酮含量,并計(jì)算提取率。

1.3 分析方法

1.3.1 總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用干燥蘆丁作標(biāo)樣,按參考文獻(xiàn) [9]測(cè) 510 nm處吸光度,以吸光度為橫坐標(biāo),濃度為縱坐標(biāo)繪圖,實(shí)驗(yàn)結(jié)果用計(jì)算機(jī)進(jìn)行線性回歸得回歸方程和相關(guān)系數(shù)如下:

式中:C為總黃酮濃度(mg/mL),A為吸光度。

1.3.2 樣品總黃酮的分析

取分離產(chǎn)物的溶液,用紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè) 510 nm處吸光度,結(jié)合回歸方程計(jì)算總黃酮質(zhì)量,按下式計(jì)算總黃酮提取率。

2 結(jié)果與討論

2.1 吸附樹(shù)脂的選擇

準(zhǔn)確稱取 5.0 g(濕重)經(jīng)預(yù)處理的大孔樹(shù)脂,置于 100 mL圓底燒瓶中,加 50 mL海金沙提取液,在振蕩器上振蕩吸附 180 min,達(dá)到吸附平衡后,測(cè)定溶液的吸光度,按下式計(jì)算吸附率,結(jié)果如圖1所示。

式中:C1為開(kāi)始吸附時(shí)海金沙溶液總黃酮濃度,C2為吸附平衡時(shí)海金沙溶液總黃酮濃度 (mg/mL)。

圖1 吸附劑種類(lèi)對(duì)總黃酮吸附率的影響

圖1結(jié)果表明:D-101大孔吸附樹(shù)脂對(duì)海金沙總黃酮的吸附率最大,其數(shù)值為 88.7%。因此,選擇 D-101大孔吸附樹(shù)脂為吸附劑。

2.2 海金沙總黃酮分離條件實(shí)驗(yàn)

2.2.1 分離條件正交試驗(yàn)

2.2.1.1 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

采用L9(34)正交試驗(yàn)法,因素水平隨機(jī)編號(hào),以海金沙總黃酮提取率為指標(biāo),研究固液比 (A),吸附溫度 (B),吸附時(shí)間 (C)和解吸劑濃度 (D)4因素對(duì)海金沙總黃酮提取率的影響,正交試驗(yàn)水平表如表1所示。

表1 L9(34)正交試驗(yàn)因素水平表

2.2.1.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與極差分析

根據(jù)正交試驗(yàn)水平表對(duì)乙醇濃度、固液比、吸附溫度和時(shí)間作四因素三水平正交試驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果和極差分析如表2所示。

表2 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析

表中 Ki值 (i=1、2、3)表示第 j列 (j=1、2、3、4)中第 i水平所對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)之和,Ki值是對(duì)應(yīng)的 Ki值的平均值,極差是 Ki的最大值與最小值之差。表2可知,各因素影響程度由大到小依次為:D>A>C>B?？傸S酮提取的優(yōu)水平為:D2A1C1B2,即固液比 1∶8(g/mL),乙醇濃度為 70%,超聲提取溫度 50℃,提取時(shí)間 90 min。

2.2.2 分離條件單因素影響實(shí)驗(yàn)

2.2.2.1 解吸劑濃度對(duì)總黃酮提取率的影響

為了考查解吸劑對(duì)總黃酮提取率的影響,在吸附固液比 1∶8(g/mL),50℃溫度下吸附 90 min,考查不同乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響,結(jié)果如圖2所示:

圖2 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響

圖2結(jié)果表明:用 70%乙醇作解吸劑,總黃酮提取率最大為 1.8%。因?yàn)榇罂讟?shù)脂分離過(guò)程包括吸附和洗脫兩步,在相同吸附條件的洗脫過(guò)程中,70%乙醇水溶液作解吸劑有利于破壞樹(shù)脂對(duì)黃酮吸附的分子間作用力和氫鍵,使黃酮容易從吸附樹(shù)脂上洗脫擴(kuò)散到溶液中。

2.2.2.2 吸附時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

為了考查吸附時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響,在吸附固液比為 1∶8(g/mL),50℃溫度下吸附一定時(shí)間,抽濾,樹(shù)脂用 70%乙醇為解吸劑洗脫黃酮化合物,結(jié)果如圖3所示:

圖3 吸附時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

圖3結(jié)果表明:隨著吸附時(shí)間的不斷增加,總黃酮的提取率增大,吸附 90 min后,總黃酮提取率增加很小,說(shuō)明吸附 90 min達(dá)到吸附平衡,平衡后,各組分含量基本不變,取吸附時(shí)間為 90 min。

2.2.2.3 固液比對(duì)總黃酮提取率的影響

吸附固液比不同,吸附劑用量不同,吸附質(zhì)的吸附量不同,總黃酮提取率將不同。為了考查吸附固液比對(duì)海金沙總黃酮提取率的影響,在 50℃溫度下吸附 90 min,抽濾,樹(shù)脂再用 70%乙醇解吸,結(jié)果如圖4所示:

圖4 吸附固液比對(duì)總黃酮提取率的影響

圖4結(jié)果表明:吸附固液比以 1∶6(g/mL)時(shí)最大,總黃酮提取率為 1.84%。因?yàn)楣桃罕仍黾?提取液用量增大,吸附劑用量相對(duì)減少,導(dǎo)致提取液中總黃酮吸附不完全,使總黃酮提取率減小。

2.2.2.4 吸附溫度對(duì)總黃酮提取率的影響

就吸附過(guò)程而言,吸附溫度的高低會(huì)直接影響吸附與解吸平衡。在吸附固液比為 1∶8(g/mL)條件下吸附 90 min,再用 70%乙醇進(jìn)行解吸,考查吸附溫度對(duì)海金沙總黃酮提取率的影響,結(jié)果如圖5所示:

圖5 吸附溫度對(duì)總黃酮提取率影響

圖5結(jié)果表明:吸附溫度在 50℃時(shí)海金沙總黃酮的提取率最高為 1.83%。50℃以下,隨溫度升高提取率增加,大于 50℃后,隨溫度升高總黃酮提取率減小。因?yàn)镈101大孔樹(shù)脂對(duì)黃酮的吸附屬物理化學(xué)吸附,低溫以化學(xué)吸附為主,化學(xué)吸附是吸熱反應(yīng),溫度升高有利于吸附;到 50℃后轉(zhuǎn)為物理吸附為主,物理吸附是放熱反應(yīng),溫度升高不利于吸附,所以黃酮提取率減小;此外,溫度升高,黃酮化合物氧化速度加快。

2.3 最佳分離條件組合實(shí)驗(yàn)

綜合正交試驗(yàn)和單因素影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定最佳分離條件為:用 70%乙醇為解吸劑,吸附固液比為 1∶6(g/mL),吸附溫度為 50℃,吸附時(shí)間為 90 min。為了考查最佳分離條件下組合實(shí)驗(yàn)效果,在此條件下做組合實(shí)驗(yàn),結(jié)果如表3所示。

表3 最佳分離工藝條件組合實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在最佳分離工藝條件下提取,總黃酮的提取率為 1.81%,5次實(shí)驗(yàn)的精密度較高,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD)為 1.602%。

3 結(jié) 論

用大孔樹(shù)脂分離海金沙總黃酮,分離效果好、吸附速度快、解吸條件溫和,不影響提取物的活性,具有較高的應(yīng)用價(jià)值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:以 70%乙醇為解吸劑,在吸附固液比為 1∶6(g/mL),50℃溫度下吸附 90 min,總黃酮提取率為 1.81%。

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