王佳賀,吳 瓊,王 鑫,何 平

金葡菌對U937細(xì)胞XIAP和c IAP1/2表達的影響＊

王佳賀1,吳 瓊2,王 鑫1,何 平1

目的 探討X-相關(guān)凋亡抑制蛋白(XIAP)和c IAP1/2在金黃色葡萄球菌(簡稱金葡菌)誘導(dǎo)的人巨噬細(xì)胞系U 937細(xì)胞凋亡中的作用。方法采用Western印跡分析檢測金葡菌感染不同時間后XIAP和c IAP1/2的表達水平;預(yù)先用不同濃度的Embelin(XIAP抑制劑)處理U 937細(xì)胞60 min,觀察金葡菌感染30 min后U 937細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果隨著感染時間的延長,XIAP和c IAP1/2的表達逐漸下降。加入XIAP的抑制劑Embelin后,U 937細(xì)胞的凋亡率隨著 Embelin的濃度增加而逐漸升高。結(jié)論XIAP和c IAP1/2參與了金葡菌誘導(dǎo)的U937細(xì)胞凋亡過程。Embelin通過特異性地抑制XIAP表達增加金葡菌誘導(dǎo)的U937細(xì)胞凋亡率。

金葡菌;細(xì)胞凋亡;U 937;XIAP;c IAP1/2

金黃色葡萄球菌(簡稱金葡菌)在自然界中廣泛存在,是臨床上常見的主要致病菌之一〔1〕。研究發(fā)現(xiàn),金葡菌可以通過多種機制逃避宿主免疫防御反應(yīng)并且引起宿主細(xì)胞凋亡〔2-4〕。然而,到目前為止,金葡菌引起宿主細(xì)胞凋亡的確切機制還不十分清楚。

凋亡蛋白抑制劑(IAPs)家族是近年發(fā)現(xiàn)的一類新的細(xì)胞內(nèi)凋亡調(diào)控蛋白,至今已發(fā)現(xiàn)8個人類IAPs家族成員,其中包括 XIAP和c IAP1/2等,它們在抑制細(xì)胞凋亡的過程中起著重要的作用〔5-6〕。其中,XIAP是 caspase的強抑制劑〔7〕。但是,關(guān)于金葡菌感染人巨噬細(xì)胞系U 937細(xì)胞與 XIAP和c IAP1/2是否有關(guān)尚未見報道。本研究中,我們探討了X IAP和c IAP1/2在金葡菌誘導(dǎo)U 937細(xì)胞凋亡過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 菌株與細(xì)胞株 金葡菌菌株Wood46由中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供,U 937細(xì)胞株由中山大學(xué)醫(yī)藥生化與分子生物學(xué)實驗室饋贈,用含10%小牛血清的RPM I 1640培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。

1.2 主要試劑 Em belin為Sigma公司產(chǎn)品;Annexin V FITC凋亡試劑盒為 RD公司產(chǎn)品;細(xì)胞培養(yǎng)試劑購自Invitrogen公司;其它所有試劑均購自Sigma公司。

1.3 準(zhǔn)備細(xì)菌 金葡菌菌株Wood46按文獻在培養(yǎng)基中培養(yǎng),離心沉淀細(xì)菌,然后用 PBS洗2次。計數(shù)金葡菌,用不含抗生素含5%小牛血清的RPM I 1640培養(yǎng)基重懸并稀釋。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及加入抑制劑 U 937細(xì)胞在10%小牛血清、2mmol/L L-谷氨酸鈉、100U/m L青霉素、和100 g/m L鏈霉素的RPM I 1640培養(yǎng)基中,于37℃5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在此實驗中的30 min組,在金葡菌感染前60 min加入不同濃度的Embelin。

1.5 金葡菌感染U937細(xì)胞 在細(xì)菌感染前,用不含抗生素的RPM I 1640培養(yǎng)基將U 937細(xì)胞清洗并重懸,濃度調(diào)整至2×106/m L,然后當(dāng)細(xì)胞∶細(xì)菌為 1∶20時分別培養(yǎng) 0 min、15 min、30 min、60 min和90 min,離心 2次(3 000 r/min,8 min)洗去未吞噬細(xì)菌,置于含20%小牛血清、青霉素及鏈霉素的RPM I 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 h,獲得感染的U937細(xì)胞。

1.6 Western blot U 937細(xì)胞經(jīng)處理一定時間后,用冷的 PBS洗3次,沉淀物在冰上用裂解液重懸20 min。4℃15 000 g離心30 m in,上清即為總的細(xì)胞蛋白溶解成分。用12%的SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳。電泳后,用蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上(50 m A 60 min)。用5%的脫脂奶粉在1×三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽水中封閉1 h。置于兔抗人一抗(用封閉液1∶2 000稀釋)中1 h。用含0.1%Tween 20洗滌液洗4次,每次 10 min。然后,將膜與過氧化物酶結(jié)合的羊抗兔二抗孵化1 h。用增強型化學(xué)發(fā)光顯色技術(shù)顯示蛋白條帶。為了保證同樣數(shù)量的蛋白,用麗春紅S染色液染色觀察蛋白帶。用含62.5 mmol/L Tris-HCl(p H 6.7),100 mmol/Lβ-巰基乙醇和2%(V/V)SDS的洗滌緩沖液60℃處理20 min。蛋白帶用光密度掃描法進行定量分析。為保證可重復(fù)性,每個Western印跡實驗用2個單獨的膜。在抑制實驗中,U 937細(xì)胞在加金葡菌處理前,先用Em belin預(yù)處理60 min。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 凋亡率用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差統(tǒng)計,SPSS10.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較用最小顯著差法。P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義,每組實驗重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 金葡菌對XIAP和c IAP1/2的影響 金葡菌作用不同時間后,免疫印跡法檢測XIAP和c IAP1/2的表達。結(jié)果顯示:隨著感染時間的延長,XIAP和c IA P1/2的表達逐漸下降,見圖1。

圖1 金葡菌感染 U937后XIAP和c IAP/2蛋白的表達Fig.1 The expressions of XIAPand c IAP/2 in S.au reus infected U937 cells＊P<0.05,＊＊P<0.01 compared with that of S.aureus alone

2.2 XIAP在金葡菌誘導(dǎo)的U 937細(xì)胞凋亡過程中的作用 用不同濃度的 Embelin預(yù)處理U 937細(xì)胞,然后用金葡菌誘導(dǎo)U 937細(xì)胞凋亡,30 min后收集細(xì)胞,用Annexin V FITC/PI雙染后流式細(xì)胞儀分析U 937細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),用Embelin阻斷XIAP后,細(xì)胞凋亡率明顯增加,見圖2。

圖2 不同濃度的 XIAP的抑制劑對 U937細(xì)胞凋亡率的影響Fig.2 Effect of different doses of XIAP inhibitor(Embelin)on S.aureus-induced U937 cell apoptosis.＊P<0.05 compared with that of S.aureus alone

3 討 論

IAPs的特殊分子結(jié)構(gòu)及抑制細(xì)胞凋亡的功能正日益受到人們的重視。IAP主要有3個結(jié)構(gòu)域,即B IR、RING、CARD 結(jié)構(gòu)域〔8〕。XIAP 為普遍表達蛋白,是 IAP家族中最具有潛在抑制活性的蛋白,它可以直接結(jié)合并抑制caspases并可多途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡〔9-10〕。Caspases家族蛋白是調(diào)控細(xì)胞凋亡發(fā)生的關(guān)鍵酶,因此XIAP是功能較強的抑凋亡蛋白之一。XIAP分子中的B IR2結(jié)構(gòu)域亦可以獨立地起到完整抑制細(xì)胞凋亡的作用。c IAP1/2含有CARD結(jié)構(gòu)域,可直接與腫瘤壞死因子相關(guān)因子(TRAFs)-TRAF2結(jié)合〔11-12〕。通過 TRAF2 的作用,c IAP1/2被整合到腫瘤壞死因子受體1和2相關(guān)的復(fù)合體中,調(diào)控受體介導(dǎo)的凋亡。

我們過去的研究發(fā)現(xiàn):金葡菌誘導(dǎo)U 937細(xì)胞凋亡過程可能與熱休克蛋白70(Heat Shock Protein,HSP70) 及核因子-κB(NF-κB)表達的改變有關(guān);Caspase-3/-9參與了金葡菌誘導(dǎo)的U 937凋亡過程并發(fā)揮了重要的作用〔13-14〕。在本研究中,我們應(yīng)用金葡菌感染所致的凋亡U 937細(xì)胞作為研究模型,探討XIAP和c IAP1/2在此過程中的作用。結(jié)果顯示,隨著感染時間的延長,XIAP和c IAP1/2的表達逐漸降低。加入XIAP的抑制劑 Embelin后,U937細(xì)胞的凋亡率隨著 Embelin濃度增加而逐漸升高。結(jié)果表明:XIAP和c IAP1/2在金葡菌誘導(dǎo)的U 937細(xì)胞凋亡過程中起到了重要的作用。

金葡菌誘導(dǎo)U 937細(xì)胞凋亡的過程包括許多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的共同參與,是一個復(fù)雜的過程。了解金葡菌誘導(dǎo)U 937細(xì)胞凋亡的確切機制對金葡菌感染的治療將起到非常重要的作用。研究表明,X IAP可以選擇性地激活c-Jun氨基末端激酶(JN K1)。XIAP可能位于NF-κB的下游。金葡菌感染U 937細(xì)胞后,XIAP和c IAP1/2與其它信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)系,尚有待進一步探討。

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Roles of XIAP1/2 and c IAP in the apoptosis of U937 cell lines induced by Staphylococcus au reus

WANG Jia-he,WU Qiong,WANG Xin,HE Ping

(Department of Geriatrics,Sheng jing H ospita l,China M edica l University,Shenyang 110004,China)

The aim of this study was to investigate the role of X-linked inhibitor of apop tosis protein(XIAP)and c IAP1/2 in the apop tosisof humanmonocytic U 937 cells induced by Staphy lococcus aureus(S.aureus).U 937 cellswere treated with S.aureus at different time points,and Western blo t were performed to detect the expressions of XIAP and c IAP1/2.The U 937 cells were p retreated with Embelin(an inhibitor for XIAP),and the apop tosis ratesof U 937 cells were detected by Annexin V FITC/PIassay.The results showed that the dow nregulation of XIAP and c IAP1/2 by S.aureus were statistically significant and inhibition of XIAPwith Embelin caused further increase in apoptosis of U 937 cells.It is concluded that XIAP and c IAP1/2 participated in the apop tosisof U 937 cells.Embelin increases U 937 cellsapo ptosis induced by S.aureus via inhibiting the expression of XIAP.

S.aureus;apop tosis;U 937;XIAP;c IAP1/2

R378.11

A

1002-2694(2010)12-1126-03

＊遼寧省教育廳科研課題(L2010701)資助

王佳賀,Email:wangjh1@sj-hospital.org

1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院老年病科,沈陽110004;

2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院涉外醫(yī)療服務(wù)中心,沈陽 110004

2010-07-12;

2010-10-08