謝榮輝,朱函坪,張曉鋒,徐 芳,楊章女,姚蘋蘋,朱智勇

浙江省豬血清中乙腦病毒的分離鑒定及抗體的測(cè)定＊

謝榮輝1,朱函坪1,張曉鋒2,徐 芳1,楊章女1,姚蘋蘋1,朱智勇1

目的 對(duì)浙江嘉興地區(qū)采集的豬血清進(jìn)行乙型腦炎病毒分離鑒定以及了解該地區(qū)豬感染乙型腦炎病毒的狀況。方法在浙江省嘉興地區(qū)采集豬血清標(biāo)本,利用病毒分離方法檢測(cè)豬血清是否攜帶乙腦病毒,利用間接免疫熒光法對(duì)豬血清進(jìn)行抗體檢測(cè)。應(yīng)用熒光定量RT-PCR方法對(duì)新分離病毒進(jìn)行鑒定;設(shè)計(jì)特異性引物,利用RT-PCR方法擴(kuò)增新分離乙腦病毒PrM—E基因,并對(duì)新分離病毒進(jìn)行基因分型和 E基因的分析。結(jié)果共采集240份豬血清標(biāo)本,抗體檢測(cè)陽(yáng)性率為61.6%。其中6月中旬50%以上的豬乙腦病毒抗體呈陽(yáng)性。分離出3株病毒。經(jīng)熒光定量RT-PCR鑒定3株病毒均為乙腦病毒,基因分析表明3株病毒均屬于基因I型乙腦病毒。對(duì)這2株乙腦病毒的 E基因區(qū)段進(jìn)行分析,它們之間核苷酸和氨基酸的同源性均為100%。與疫苗株SA 14-14-2相比,核苷酸同源性在87.7%,氨基酸同源在97.0%以上。結(jié)論浙江省嘉興地區(qū)豬群中存著乙腦病毒的隱性感染或曾經(jīng)感染過(guò),提示在該地區(qū)自然界中存在著乙腦病毒。

乙腦病毒;E基因;抗體;序列分析

乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV),簡(jiǎn)稱乙腦病毒,是引起流行性乙型腦炎的病原體。乙型腦炎是以三帶庫(kù)蚊為主要傳播媒介的人獸共患病,病毒通常在蚊—豬—蚊等動(dòng)物間循環(huán),其中豬被認(rèn)為是乙腦最重要的傳染源和乙腦病毒傳播的主要宿主,在乙腦的流行環(huán)節(jié)上起重要的作用。因此加強(qiáng)對(duì)豬感染乙腦病毒的監(jiān)測(cè)有助于了解乙腦病毒的循環(huán)情況,可為預(yù)測(cè)人群乙腦流行趨勢(shì)提供依據(jù)。本研究于2008年在浙江省嘉興地區(qū)采集豬血清并對(duì)其進(jìn)行病毒分離和抗體檢測(cè),以了解目前乙腦病毒在自然界的情況,為預(yù)防和控制該病在人群中的流行提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 Taq酶,膠回收試劑盒和X-gal購(gòu)自 Ta KaRa公司;RNA提取試劑盒購(gòu)自Qiagen公司,M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和質(zhì)粒載體p GEM-T試劑盒購(gòu)自Promega公司。乙腦病毒抗原片由本實(shí)驗(yàn)室制備,其他試劑均為分析純。

1.1.2 細(xì)胞和培養(yǎng)液 金黃地鼠腎細(xì)胞(BHK-21)細(xì)胞由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒所提供,細(xì)胞培養(yǎng)采用M EM基礎(chǔ)培養(yǎng)基,加10%胎牛血清作生長(zhǎng)液,維持液含3%的胎牛血清。

1.1.3 標(biāo)本來(lái)源 2008年5月上旬至8月下旬在浙江省嘉興市海寧豬舍采集2008年初出生的豬血清標(biāo)本共240份。

1.1.4 豬血清中乙腦病毒抗體的檢測(cè) 間接免疫熒光檢測(cè)豬血清乙腦病毒總抗體。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本處理與接種 將100μL豬血清加入到300μL含500U M EM培養(yǎng)基中,4 ℃12 000 r/m in離心15min。取0.3mL上清液接種于BHK-21細(xì)胞中,置37℃吸附1h,棄去殘余液體,加入維持液,于37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),每日觀察細(xì)胞病變,連續(xù)傳3代,無(wú)病變者棄去。

1.2.2 Real-time RT-PCR檢測(cè)乙腦病毒 用 Total RNA提取試劑盒(Qigene公司)按說(shuō)明書提取新分離病毒感染細(xì)胞的總RNA。用 TaKaRa公司One Step RNA PCR Kit進(jìn)行一步法熒光定量RTPCR檢測(cè)標(biāo)本中的乙腦病毒核酸。反應(yīng)體系:2xOne step RT-PCR buffer III 10μL,上游引物 (20 μmol/L)5′-GGCTCTTA TCACGTTCTTCAAGT TT-3′(239-263)0.2μL,下游引物 (20μmol/L)5′-TGCTT TCCA TCGGCCYAAAA-3′(289-308)0.2μL,探針 (10μmol/L):5′(FAM)-AGCA TTAGCCCCGACCAAGG CG-(TAMRA)-3′(266-287)0.2μL,PrimeScrip tTMRT Enzyme M ix II 0.4μL,Ta KaRa ExTaqTMHS 0.4μL,RNA 模板8.6μL總體積為20μL。充分混勻后。42 ℃逆轉(zhuǎn)錄10 min,95℃預(yù)變性10s,95℃5 s,57℃30 s,40個(gè)循環(huán),由儀器自動(dòng)設(shè)置每個(gè)循環(huán)57℃退火/延伸步驟讀取熒光信號(hào)。結(jié)果鑒定:在陰、陽(yáng)性對(duì)照均成立時(shí),若病毒在35個(gè)循環(huán)前有明顯的擴(kuò)增曲線,則該病毒為乙腦病毒。

1.2.3 病毒PrM和E基因區(qū)段的PCR擴(kuò)增及同源性分析 用Total RNA提取試劑盒Rneasy M ini Kit(Qigene公司)按說(shuō)明書提取感染病毒的第3代細(xì)胞的總RNA。根據(jù)已發(fā)表的乙腦病毒基因序列合 成 引 物 :P1:5′-CGTTCTTCAAGTTTACAGCA TTAGC-3′,P2:5′-TTAAGCA TGCACA TTGGTCG CTAA-3′利用下游引物 P2以病毒基因組RNA為模板進(jìn)行RT。反應(yīng)條件如下:全基因使用MLV逆轉(zhuǎn)錄酶,參照說(shuō)明書進(jìn)行操作。PCR循環(huán)參數(shù)為94℃預(yù)變性 2min,94℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸2min,30次循環(huán)后,72℃延伸10min,最后置于4℃。PCR產(chǎn)物在瓊脂糖上進(jìn)行電泳后用膠回收試劑盒純化產(chǎn)物并克隆入 T載體送上海生工測(cè)序。用Clustal X和DNAstar進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列分析。

2 結(jié) 果

2.1 病毒分離 對(duì)240份豬血清處理后接種于BHK-21細(xì)胞,結(jié)果分離到3株病毒,分別命名為JX61、JX66、JX67。這 3株病毒可在 BHK-21細(xì)胞中獲得穩(wěn)定傳代,細(xì)胞病變主要表現(xiàn)細(xì)胞聚集、固縮并逐漸脫落。

2.2 新分離病毒的熒光定量RT-PCR鑒定 對(duì)新分離的病毒提取RNA,進(jìn)行乙腦病毒熒光定量RTPCR鑒定,經(jīng)過(guò)40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增,通過(guò)分析擴(kuò)增曲線,發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性對(duì)照呈現(xiàn)S型,Ct值為10.86,陽(yáng)性對(duì)照成立。正常細(xì)胞的陰性對(duì)照的擴(kuò)增曲線為平滑直線,故陰性對(duì)照成立。3株病毒的擴(kuò)增曲線均呈S型,Ct值14.26至17.85之間。均小于35,可判定該3株分離毒株為乙腦病毒。

2.3 豬乙腦病毒抗體檢測(cè)結(jié)果 用間接免疫熒光法共檢測(cè)240份豬血清,有148份陽(yáng)性,總陽(yáng)性率為61.6%。5月份豬乙腦抗體水平最低,為21.7%,6、7月漸漸上升分別為63.3%和76.7%,8月最高為91.7%,其中6月份有50%以上的豬血清中乙腦病毒抗體呈陽(yáng)性。

2.4 新分離病毒的基因分型 采用Chen等建立的基因分型方法對(duì)新分離的乙腦病毒進(jìn)行基因分型鑒定,選擇病毒基因組456～695位,屬于 PrM區(qū)的240個(gè)核苷酸序列作為基因分型的基礎(chǔ)〔2〕。結(jié)果顯示,新分離的3株乙腦病毒均屬基因 I型。與浙江仙居分離株、上海分離株及四川分離株較為相近,見(jiàn)圖1。

2.5 新分離病毒E基因核苷酸及氨基酸分析 采用減毒活疫苗株 SA 14-14-2為標(biāo)準(zhǔn),對(duì)新分離JX61、JX66和JX67的E基因核苷酸及氨基酸進(jìn)行分析。這3株經(jīng)熒光定量RT-PCR鑒定為乙腦病毒。3株之間的核苷酸同源性和氨基酸同源性均為100%,與疫苗株的核苷酸同源性87.7%,氨基酸同源性為97.0%。新分離毒株與減毒活疫苗株存在著15個(gè)共同的氨基酸差異,分別位于Domain I區(qū)的 E-138、E-176和 E-177位,Domain II區(qū)的 E-107、E-129、E-222、E-244、E-264 和 E-279 位,Domain III區(qū)的 E-315、E327和 E-356位,還有位于這3個(gè)活性區(qū)外的 E-433、E-439和E447位。新分離的3株乙腦病毒與國(guó)內(nèi)其他基因I型病毒的核苷酸同源性在97.5%～99.3%。氨基酸同源性為98.4%～99.8%。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)中國(guó)各地分離的基因I型乙腦病毒核苷酸及氨基酸的同源性比較高,所有基因I型乙腦病毒之間的核苷酸和氨基酸的差異均不大,但與 II、III、IV之間的核苷酸差異較大,而氨基酸差異并不明顯。

圖1 PrM基因核苷酸序列系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)分析Fig.1 Phylogenetic tree analysis of Pr Mgene nuclectide sequence

3 討 論

本次調(diào)查研究中240份豬血清樣本中乙腦IgG抗體陽(yáng)性148份,陽(yáng)性率為61.6%(148/240)。表明豬群中存著乙腦病毒的的隱性感染或曾經(jīng)感染過(guò),豬可能是嘉興地區(qū)乙型腦炎傳播的主要環(huán)節(jié)之一。研究表明:家豬,尤其仔豬是乙腦的主要擴(kuò)散宿主,豬血清50%乙腦抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)時(shí)間出現(xiàn)早或晚直接影響著人間乙腦發(fā)病情況,因此,監(jiān)測(cè)豬乙腦病毒感染情況是預(yù)測(cè)人間乙腦疫情的重要手段之一〔3〕。本研究發(fā)現(xiàn):豬乙腦抗體陽(yáng)性最早在5月份出現(xiàn),6、7和8月份抗體陽(yáng)性率逐漸升高,表明乙腦病毒5～8月份已在該地區(qū)自然界中開(kāi)始傳播,這也跟當(dāng)?shù)?0%～90%病例集中在6～8月相符合。且發(fā)現(xiàn)豬乙腦血清抗體50%陽(yáng)轉(zhuǎn)率出現(xiàn)在6月,而分析近年來(lái)浙江省乙腦流行情況表明乙腦發(fā)病主要集中在7月,占68.5%;次為 8月,占 17.94%。二者綜合分析表明豬乙腦抗體50%陽(yáng)轉(zhuǎn)率3～4w后將出現(xiàn)乙腦發(fā)病的高峰期。

本研究從浙江嘉興地區(qū)采集的豬血清標(biāo)本新分離到3株乙腦病毒都屬于基因I型,與浙江仙居、上海、四川、云南、遼寧等地的基因I型乙腦病毒差異不大,表明國(guó)內(nèi)基因I型乙腦病毒具有較高的同源性。

乙腦病毒E蛋白是病毒表面的重要成分,由它形成的表面抗原決定簇,具有血凝活性和中和活性,存在著3個(gè)活性結(jié)構(gòu)域,其基因的變異會(huì)導(dǎo)致病毒毒力和抗原性的改變〔4-5〕。浙江嘉興分離到的乙腦病毒E基因與疫苗株SA 14-14-2雖然核苷酸的差異較大,但氨基酸同源性較高。新分離株與疫苗株在E蛋白有15個(gè)共同的氨基酸位點(diǎn)差異,其中結(jié)構(gòu)域 I有3個(gè),結(jié)構(gòu)域 II有6個(gè),結(jié)構(gòu)域 III有3個(gè)。而結(jié)構(gòu)域 III是乙腦病毒中和抗體結(jié)合的重要區(qū)域 ,特別是 E337-E34、E377-E382、E397-403 區(qū)域發(fā)生變異會(huì)導(dǎo)致抗原性改變,影響抗原與中和抗體的結(jié)合反應(yīng),通過(guò)對(duì)比和分析,新分離株與疫苗株在上述區(qū)域完全一致,此外在影響病毒毒力的 E138和影響病毒細(xì)胞免疫的 E60-E68位均完全一致,提示新分離株抗原性與疫苗株沒(méi)有差異,現(xiàn)行的疫苗對(duì)新分離株具有預(yù)防作用。對(duì)中國(guó)各地分離的基因I型乙腦病毒核苷酸及氨基酸的同源性比較發(fā)現(xiàn),所有基因I型乙腦病毒之間的核苷酸和氨基酸的差異均不大,但與其他基因型別的乙腦病毒的核苷酸差異較大,而氨基酸差異并不明顯。提示目前的疫苗株理論上能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體,并對(duì)我國(guó)目前的基因I型乙腦流行株提供保護(hù)。

〔1〕Tsai TF.New initiatives for the control of Japanese encephalitis by vaccination:minutes of a WHO/CV 1 meeting,Bangkok,Thailand,13-15 october 1998〔J〕.Vaccine,2000,26(Suppl 2):1-25.

〔2〕Chen WR,Tesh RB,Rico-Hesse R,et al.Genetic Variation of Japanese encephalitis virus in nature〔J〕.J Gen Virol,1990,71(12):2915-2922.

〔3〕陶三菊.流行性乙型腦炎的流行監(jiān)測(cè)及預(yù)防〔J〕.中國(guó)計(jì)劃免疫,2002,8:226-230.

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〔6〕Wu SC,Lin CW.Neutralizing pep tide ligands selected from phage displyed libraries mimic the conformational epitope on domain III of the Japanese encephalitis virus envelope protein〔J〕.Virus Res,2001,76(1):69.

Isolation of Japanese encephalitis virusand detection of an tibody against Japanese encephalitis virus in serum of swine from Zhejiang

X IE Rong-hui,ZHU Han-ping,ZHANG Xiao-feng,XU Fang,YANG Zhang-nv,YAO Ping-ping,ZHU Zhi-yong

(Zhejiang Provincial Center for Disease Control and Prevention,Hangzhou 310009,China)

In order to study Japanese encephalitis virus carried by swine and investigate serum from Jixin region in Zhejinag p rovince antibodies against JEV were tested by IFA.Japanese encephalitis virus in sera were detected by virus isolation.The isolated strains were identified by real time RT-PCR.The Prm-E gene of the isolated viruswasamplified by RT-PCR.The result showed that antibodies against JEV were found in 148 out of 240 serum samples and the total positive rate was 61.6%.Three strains were isolated with cytopathogenic effect(CPE)in BHK-21.The phylogenetic analysis showed that the new isolates belonged to genotype I of JEV.Sequence analysis showed that the homology of nucleo tide sequences and amino acid sequences among three strains were 100%.Compared with the nucleotide sequences between two strains and the JEV vaccine strain SA 14-14-2,the homology was up to 87.7%,and homology of amino acid sequences were up to 97.0%.Compared with the vaccine strain,there were 15 common amino acid sequences in all the three strains.

Japanese encephalitis virus;E gene;antibody;sequence analysis

R373

A

1002-2694(2010)12-1123-03

＊浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科學(xué)研究基金資助項(xiàng)目(2008B39)

謝榮輝,Email:ghost_rhxie@hotmail.com

1.浙江省疾病預(yù)防控制中心,杭州 310051;2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,杭州 31002

2010-05-20;

2010-09-03