段博芳,張利仙,段 綱,董 俊,葉玲玲,周曉黎,徐志斌,艾 軍

豬流感 H1N1亞型 NP基因桿狀病毒表達(dá)載體構(gòu)建及其在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)＊

段博芳1,張利仙2,段 綱1,董 俊3,葉玲玲3,周曉黎3,徐志斌4,艾 軍3

目的 獲得研發(fā)A型豬流感病毒EL ISA檢測(cè)試劑盒和制備NP蛋白單克隆抗體的抗原物質(zhì)。方法根據(jù)已報(bào)道的豬流感病毒 H1N1亞型NP基因序列(GenBank登錄號(hào):GQ422386)人工合成NP基因,通過 XbaⅠ和 Eco RⅠ特異性酶切,將NP基因克隆于昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體p FastBacHTB,經(jīng)PCR、酶切、測(cè)序鑒定后,獲得攜帶NP基因的重組質(zhì)粒p Fast-BacHTB-NP。該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化含有桿狀病毒穿梭載體的DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)抗生素、PCR篩選,獲得轉(zhuǎn)座的桿粒Bacmid-NP。在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細(xì)胞,獲得重組桿狀病毒,再感染細(xì)胞,收獲目的蛋白。結(jié)果通過SDS-PAGE和Western blotting分析表明該蛋白得到表達(dá),且具有良好的生物活性,大小約為57KD。結(jié)論實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明已成功構(gòu)建了攜帶NP基因的重組質(zhì)粒p FastBacHTB-NP和轉(zhuǎn)座的桿粒Bacmid-NP,轉(zhuǎn)染后在sf9昆蟲細(xì)胞上成功的表達(dá)。

H1N1;NP基因;桿狀病毒表達(dá)載體;昆蟲細(xì)胞

豬流感(Sw ine influenza,SI)是由正粘病毒科A型流感病毒引起的,臨床上以突發(fā)、高熱、咳嗽、呼吸困難、衰竭和死亡為特征的呼吸道傳染病,是豬的主要免疫抑制病之一〔1〕。1918年美國(guó)首次報(bào)道了SI的暴發(fā),1930年Shope從豬體中首次分離到了H1N1亞型豬流感病毒(Sw ine influenza virus,SIV)。迄今為止,已發(fā)現(xiàn)的 SIV包括 H1N 1、H1N2、H1N 7、H3N 2、H3N1、H4N 6、H5N1 和H9N2等亞型〔2-6〕。2009年甲型 HlN1流感引發(fā)的全世界流感疫情再次證明控制豬流感的重要性。因此,開發(fā)診斷和預(yù)防豬流感的制劑顯得尤為迫切。

流感病毒亞型眾多,但其核蛋白相對(duì)保守,具有型和種屬的特異性,不僅是病毒特異性細(xì)胞毒 T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL)的重要靶標(biāo)〔7〕,而且最新研究表明針對(duì)NP的抗體有助于抵抗流感病毒感染〔8〕,據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道〔9-10〕,重組表達(dá)的NP蛋白作為抗原,均能檢測(cè)A型流感病毒對(duì)應(yīng)各亞型血清抗體。這也是流感病毒型分類和診斷的基礎(chǔ)。

流感病毒抗體檢測(cè)中,最重要的是抗原的制備,傳統(tǒng)制備流感病毒抗原的方法是活病毒接種雞胚或細(xì)胞,此法不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力,且易引起病毒泄漏和實(shí)驗(yàn)操作者的感染。本研究參照2009年分離株在NCB I上傳的A型流感病毒NP基因序列,利用人工合成基因,在sf-9昆蟲細(xì)胞上獲得了高活性NP蛋白,此重組蛋白較傳統(tǒng)制備病毒抗原安全便捷,可作為替代全病毒研制A型豬流感病間接EL ISA檢測(cè)試劑盒和制備NP蛋白單克隆抗體理想的抗原物質(zhì)。

1 材料和方法

1.1 質(zhì)粒和菌種 pBluescrip tsk-NP重組質(zhì)粒(攜帶人工合成的豬流感H 1N 1亞型NP基因)其中NP基因參照序列來自 GenBank(登錄號(hào):GQ422386),由大連寶生物工程有限公司合成。p FastBacH TB質(zhì)粒、E.coil.Top10和DH10Bac菌株,為云南出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)檢實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑 質(zhì)粒小量提取試劑盒、凝膠回收試劑盒購(gòu)于 AxyGEN公司,限制性內(nèi)切酶 EcoR I和Xba I、DNA M arker、T4連接酶購(gòu)于 TaKaRa公司;Cellfectin轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司;胎牛血清、Grace’s細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自 GB ICO公司;抗 His單抗購(gòu)自天根生化科技有限公司,山羊抗小鼠IgG/辣根酶(HRP)標(biāo)記購(gòu)自Southern Biotech公司。1.3 設(shè)計(jì)引物與合成堿基 根據(jù)NP基因序列設(shè)計(jì)了一對(duì)引物用于擴(kuò)增NP基因,下劃線部分分別為 E.coR I和 Xba I酶切位點(diǎn) N 1:5′-gggGAA TTCAAA TGGCGTCTCAAGGCACC-3′和 N 2:5′-ggg TCTAGA TTAA TTGTCA TACTCCTCTG-3′,跨幅1 497bp。通用引物(M 13)序列參照Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)使用手冊(cè),引物均由 Invitrogen公司合成。

1.4 目的基因擴(kuò)增及鑒定 用設(shè)計(jì)的特異性引物N1/N2對(duì)重組質(zhì)粒pBluescrip tsk-NP進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件:94℃3min;94℃30s,52℃35s,72℃1min 40s,共30個(gè)循環(huán);72℃7min;4℃保溫。反應(yīng)結(jié)束后,瓊脂糖凝膠電泳鑒定。同時(shí),重組質(zhì)粒用 EcoRI和Xba I雙酶切鑒定。

1.5 p FastBacH TB-NP重組質(zhì)粒的構(gòu)建 用E.coR I和 Xba I酶切pBluescrip tsk-NP重組質(zhì)粒,回收NP片段,與經(jīng)過相同處理的p FastBacH TB相連。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入 TOP10感受態(tài)細(xì)胞,提取質(zhì)粒,對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增、酶切和測(cè)序鑒定。

1.6 重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建 將陽性質(zhì)粒p FastBacH TB-NP轉(zhuǎn)化于含有桿狀病毒穿梭載體的DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞,構(gòu)建桿狀病毒表達(dá)載體,通過卡那霉素、四環(huán)素和慶大霉素篩選重組轉(zhuǎn)座子Bacm id-NP,提取桿粒,分別用M 13引物和NP引物進(jìn)行PCR鑒定。

1.7 重組桿粒在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá) 按照 Invitrogen Bac-to-Bac Baculovirus Exp ression System使用說明手冊(cè)進(jìn)行,將重組轉(zhuǎn)座子Bacmid-NP的DNA在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的sf9昆蟲細(xì)胞,設(shè)熒光蛋白轉(zhuǎn)染為對(duì)照。盲傳后,經(jīng)3輪純化,收獲含有NP基因的重組桿狀病毒。

1.8 重組表達(dá)蛋白的SDS-PA GE和Western blot分析 參照文獻(xiàn)〔11〕,取重組病毒感染細(xì)胞裂解物上清用12%的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE。將電泳后的凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)印硝酸纖維膜,一抗為抗 His標(biāo)記的小鼠抗體(1∶3 000),二抗為山羊抗鼠 IgG/辣根酶(HRP)標(biāo)記(1∶3 000),以正常細(xì)胞上清為陰性對(duì)照,按常規(guī)步驟做Western blot。

1.9 重組表達(dá)蛋白的純化濃縮 按照 His·Bind Purification Kit的說明書進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因鑒定 用引物N 1/N 2對(duì)重組質(zhì)粒pBluescrip tsk-NP進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物為1 497bp,見圖1,雙酶切結(jié)果見圖2,均與理論值相符。

圖1 pBluescriptsk-NP PCR鑒定1:N1/N 2擴(kuò)增片段;2:陰性對(duì)照M 1:DL 2 000 DNA MarkerFig.1 PCR amplified of pBluescriptsk-NP 1:Amplified product of pBluescrip tsk-NP with the N1/N2 p rime;2:negative control;M 1:DL2 000

圖2 pBluescriptsk-NP酶切鑒定1:Xba I&Eco RⅠ酶切片段;M 1:DL 5 000DNA Marker;M 2:DL 2 000 DNA MarkerFig.2 Enzyme digestion of p Bluescriptsk-NP 1.Xba I&Eco RⅠenzyme digestion of pBluescrip tsk-NP;M 1:DL50 000;M 2:DL2 000

2.2 重組質(zhì)粒p FastBacH TB-NP的鑒定 重組質(zhì)粒pBluescrip tsk-NP和質(zhì)粒p FastBacH TB經(jīng)Eco RI和 Xba I酶切處理后,連接,轉(zhuǎn)化構(gòu)建的重組質(zhì)粒p FastBacHTB-NP。用引物N1/N2對(duì)其進(jìn)行PCR鑒定,擴(kuò)增產(chǎn)物為1 497bp,與理論值相符。經(jīng)Eco RI和 Xba I雙酶切,酶切產(chǎn)物分別為1 497bp和4 805bp見圖3,均與理論值相符。經(jīng)進(jìn)一步序列分析驗(yàn)證插入的基因含有豬流感 H 1N 1亞型NP基因的完整開放閱讀框架,鑒定結(jié)果表明:成功構(gòu)建了昆蟲桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒p FastBacH TB-NP。

2.3 轉(zhuǎn)座桿粒的PCR鑒定 p FastBac H TB-NP轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)慶大霉素、卡那霉素、四環(huán)素篩選后,提取其DNA,用M 13正向和反向引物進(jìn)行 PCR鑒定,擴(kuò)增產(chǎn)物為3 927bp見圖4,表明NP基因已經(jīng)轉(zhuǎn)座成功。

2.4 重組表達(dá)蛋白的SDS-PAGE和Western blot

將重組病毒感染細(xì)胞裂解上清用12%的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE,結(jié)果在57kD左右可見表達(dá)產(chǎn)物,和預(yù)期大小一致,見圖5。Western blot檢測(cè),在約57kD處出現(xiàn)特異性印跡,而正常細(xì)胞上清中在此位置沒有出現(xiàn)特異性印跡,見圖6。

2.5 重組表達(dá)蛋白的純化 采用 His·Bind Purification多聚組胺酸融合蛋白純化柱子進(jìn)行小量純化,經(jīng) SDS-PAGE分析,可見在57kD處幾乎只有一條蛋白條帶見圖7,分子大小與直接用細(xì)胞裂解上清進(jìn)行SDS-PAGE出現(xiàn)的重組表達(dá)產(chǎn)物的質(zhì)量大小一致,Western blot檢測(cè),在約57kD處出現(xiàn)特異性印跡,證實(shí)了重組目的蛋白得到了很好的純化。

3 討 論

自2009年4月甲型 H1N 1在全世界大流行以來,國(guó)內(nèi)外各界對(duì)SIV越來越關(guān)注,一是由于豬呼吸道上皮細(xì)胞表面同時(shí)存在人流感病毒受體SA-a-2、6Gal、禽流感病毒(avian influenza virus,A IV)受體SA-a-2和3Gal,這樣豬既可感染人流感病毒又可感染A IV,從而成為人-禽流感病毒重組的理想“混合器”〔12〕,另一方面歷史上每次人流感的大流行都與豬流感密切相關(guān),致使豬流感在公共衛(wèi)生學(xué)上具有重要的意義。

本試驗(yàn)人工合成NP基因,通過克隆將其插入p FastBacH TB,成功構(gòu)建了桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)移載體p FastBacH TB-NP,在脂質(zhì)體介導(dǎo)下在昆蟲細(xì)胞中成功表達(dá),這為NP蛋白進(jìn)一步應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。本試驗(yàn)克隆的核蛋白是流感病毒的保守蛋白,具有種群和型的特異性,是瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)抗原的主要成分,也是流感病毒診斷最具代表性的蛋白。郭利敏〔13〕等通過原核表達(dá)系統(tǒng)獲得了 H3N 2亞型豬流感核蛋白并對(duì)其進(jìn)行抗原性分析結(jié)果顯示,表達(dá)的NP蛋白能與其他亞型的SIV陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng),證明了表達(dá)蛋白的反應(yīng)原性、交叉反應(yīng)性和免疫原性。倪建強(qiáng)〔14〕等亦通過構(gòu)建p ET-NP原核表達(dá)載體成功表達(dá)了NP蛋白并將其初步應(yīng)用于診斷中。然而,原核表達(dá)系統(tǒng)缺少表達(dá)蛋白的后加工,使得表達(dá)蛋白與病毒所表達(dá)的蛋白同源性差,直接將其應(yīng)用于診斷特異性差,易引起誤診。本試驗(yàn)中選用的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng),能對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行糖基化、磷酸化等一系列蛋白質(zhì)翻譯加工修飾,表達(dá)產(chǎn)量高,而且昆蟲細(xì)胞與脊椎動(dòng)物親緣關(guān)系遠(yuǎn),抗原交叉反應(yīng)低,這為制備高活性、高產(chǎn)量抗原創(chuàng)造了有利條件。有文獻(xiàn)報(bào)道〔15-19〕:使用重組表達(dá)NP蛋白進(jìn)行的EL ISA結(jié)果提示,真核重組表達(dá)的NP蛋白具有很好的特異性和敏感性,可以作為全病毒的替代抗原,用于開發(fā)診斷抗原有較好的代表性和較大的實(shí)用價(jià)值,作為流感的型診斷抗原具有很廣泛的應(yīng)用前景,并能摒棄傳統(tǒng)診斷豬流感費(fèi)時(shí)費(fèi)力,對(duì)活病毒進(jìn)行直接操做危險(xiǎn)和不易推廣的不足。

據(jù) Chitra Upadhyay 等〔9-10,20〕報(bào)道 :利用重組表達(dá)蛋白建立的NP-EL ISA檢測(cè)方法能檢測(cè)所有A型流感病毒感染的血清抗體,在大規(guī)模流感血清抗體監(jiān)測(cè)中,EL ISA檢測(cè)方法優(yōu)于血凝試驗(yàn)(H I)等檢測(cè)方法。本研究中,利用桿狀病毒表達(dá)載體構(gòu)建表達(dá)的重組NP蛋白參照A型豬流感病毒株設(shè)計(jì),根據(jù)相關(guān)的理論報(bào)道提示,此表達(dá)的蛋白將可作為A型豬流感的診斷抗原,為研制A型豬流感病間接EL ISA快速檢測(cè)試劑盒和制備NP蛋白單克隆抗體提供了抗原物質(zhì),對(duì)豬流感的預(yù)防控制、診斷治療具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

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Construction of baculovirus transfer vector NP gene of swine influenza virus(H1N1)and its expression in insect cells

DUAN Bo-fang,ZHANG Li-xian,DUAN Gang,DONG Jun,YE Ling-ling,ZHOU Xiao-li,XU Zhi-bing,A IJun

(Yunnan A gricultural University,Kunm ing 650201,China)

In order to gain antigenic p roperties thatwas used to construct an EL ISA kit to test SIV antibody and to p repare monoclonal antibody,NP gene of A/Sw ine/Influenza Virus/2009(H1N 1)was syntheticed acco rding to the repo rted SIV virus NP gene(GenBank accession number:GQ422386).The NP gene fragment was cloned into the vector p FastBacHTB.The recombinant plasmid p FastBacHTB-NPwas constructed and identified by PCR and enzyme digestion and sequenced.Then the plasmid p FastHTB-NPwas transformed into DH10Bac complement cellsand identified by antibioticsand PCR.It is showed the baculovirus expression vecto r to NP gene was constructed.On this basis,transposition bacmid DNA was extracted to transfect sf9 insect cells.After 96 hours,baculovirus was harvested.Then the SDS-PAGE and western blotting showed that the NP protein was expressed in insect cells.It has a good biological activity and isapp roximate 57kDa.It isa base to construct an EL ISA kit to test SIV antibody and to p reparemonoclonal antibody.The result showed that the recombinant plasmid p Fast-BacHTB-NP and baculovirus expression vector to NP gene were constructed,and the NP gene was expressed in insect cells.

swine influenza virus(H1N1);NP Gene;baculovirus expression vecto r;insect cells

R373.1

A

1002-2694(2010)12-1118-05

＊云南省社會(huì)發(fā)展科技計(jì)劃(2009ZC189M)資助

艾軍,Email:ajun915@tom.com;duanbofang@126.com

1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué),昆明 650201;2.昆明理工大學(xué),昆明 650224;3.云南出入境檢驗(yàn)檢疫局,昆明 650228;4.澄江縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,玉溪 652500

2010-06-15;

2010-09-20