張守文，尹蕾，周玉玲

（1.黑龍江省食品藥品監(jiān)督管理局，哈爾濱 150020；2.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150076）

乳品中有害微生物的檢測技術(shù)和發(fā)展方向

張守文1，尹蕾2，周玉玲2

（1.黑龍江省食品藥品監(jiān)督管理局，哈爾濱 150020；2.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150076）

從食品安全的角度出發(fā)，系統(tǒng)地介紹了乳品中主要高危害致病菌及其危害、檢測方法的歷史進程、當(dāng)前國內(nèi)外乳中有害微生物的檢測方法、乳中微生物檢測技術(shù)的發(fā)展方向。

乳品，微生物，檢測技術(shù)，發(fā)展方向

0 引 言

近年來，乳品安全事件頻繁發(fā)生，其中大部分是由于污染致病菌引起的大規(guī)模乳品中毒事件。2008年，珠海、江門兩市多家幼兒園發(fā)生飲用乳制品中毒事件[1]，后經(jīng)調(diào)查該批牛奶中含有大量金黃色葡萄球菌。這一事件再次使乳品安全問題成為社會各界關(guān)注的焦點。

乳以安為重。有害菌的快速檢驗和有效鑒定對乳品的質(zhì)量和安全有著重要意義。目前，常規(guī)的乳品檢測手段有微生物法、理化法和免疫法等，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，PCR技術(shù)、基因芯片、流式細胞技術(shù)等技術(shù)也被用于乳品中微生物的檢測鑒定。本文綜述了乳品中有害致病菌的檢測技術(shù)及其發(fā)展動態(tài)和趨勢。

1 乳中主要有害微生物及其危害

乳品中常見病原菌檢測品種有：沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森式菌、單增李斯特氏菌、大腸桿菌、耶爾森氏菌、空腸彎曲菌等，包括阪崎腸桿菌。這些致病菌可引起人類劇烈嘔吐、腹瀉、虛脫、急性胃腸炎等，甚至危及生命。2002年，美國FDA在某一國際乳業(yè)巨頭公司生產(chǎn)的嬰幼兒配方奶粉中新檢出了一種致病菌——阪崎腸桿菌，可以引發(fā)嬰兒、尤其早產(chǎn)兒腦膜炎、敗血癥及壞死性結(jié)腸炎散發(fā)和爆發(fā)，由阪崎腸桿菌引發(fā)疾病而導(dǎo)致的死亡率可達40%～80%。2003年又一家國際公司主動召回了一批檢出極微量阪崎腸桿菌的罐裝早產(chǎn)兒特殊配方奶粉，阪崎腸桿菌從此成為世界乳業(yè)矚目的焦點。2008年，我國國家質(zhì)檢總局公布了味全奶粉、澳優(yōu)乳品均被檢驗出含有致病菌阪崎腸桿菌。聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織經(jīng)過風(fēng)險性評估，將阪崎腸桿菌和沙門氏菌共同列為嬰幼兒配方奶粉A類致病菌。

2 檢測方法的歷史進程

通常檢測食物病原體有多種方法，17世紀中葉荷蘭人呂文虎克用自制的簡單顯微鏡觀察并發(fā)現(xiàn)了許多微生物。Widal[2]于1896年利用傷寒病人血清與傷寒桿菌發(fā)生特異性凝集的現(xiàn)象成功地診斷傷寒病，這便是免疫學(xué)方法的初步運用。18世紀，體液酶的分析通過堿性磷酸酶檢測肝功能；血清淀粉酶檢測胰腺炎；酶類標志物檢測心臟?。?9世紀，放射及酶聯(lián)免疫分析激素檢測內(nèi)分泌功能；腫瘤標志物檢測癌癥；蛋白標志物檢測心臟病；到了20世紀，生化檢測方法檢測糖尿病、心血管病等；21世紀，應(yīng)用分子生物學(xué)，通過實時定量PCR分子診斷儀實現(xiàn)基因診斷食品安全、病原體及傳染、腫瘤、遺傳病等。

3 乳中有害微生物檢測方法

不論是用于生產(chǎn)、零售還是未指明用途的乳和乳制品，絕大多數(shù)國家對沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌、彎曲桿菌、產(chǎn)氣夾膜梭菌以及大腸桿菌5467均要求不得檢出，而大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌的檢測則有不同的限量標準[3]。

3.1 微生物學(xué)檢測方法

傳統(tǒng)的微生物學(xué)檢測方法有標準平板計數(shù)法（SPC）和顯微鏡直接觀察法（DMC），是最普通的活菌總數(shù)測定法，也是絕大多數(shù)企業(yè)和質(zhì)檢部門最常用的兩種方法。傳統(tǒng)的微生物學(xué)檢測方法具有所需設(shè)備簡單，成本相對較低的優(yōu)點，但其操作繁瑣，檢測周期長，且靈敏度較低，并且對于有些細菌無法給出正確鑒定[4]。皿膜系統(tǒng)與即用膠系統(tǒng)法、疏水網(wǎng)格濾膜法、螺旋板系統(tǒng)均是學(xué)者們對這兩種方法在提高操作效率和細胞計數(shù)方面的改進。疏水網(wǎng)格濾膜法優(yōu)點是濃縮靶細菌,去除樣品中的抑制因子,轉(zhuǎn)移過程不需要再懸浮以免使菌體遭受物理破壞。濾膜法被廣泛應(yīng)用于生乳、巴士殺菌乳的質(zhì)量管理中。

此外，為了克服人工計數(shù)的緩慢與疲勞，許多學(xué)者發(fā)明了全自動菌落計數(shù)系統(tǒng)，如英國Bibby SC5菌落計數(shù)器，Spiral Biotech公司的CASBATM，Celsis公司的Scan500及Synopitics公司的全自動菌落計數(shù)器，均可快速、準確地計數(shù)。

3.2 生物電化學(xué)方法

生物電化學(xué)方法[5]是指通過電極測定生物量產(chǎn)生或消耗的電荷提供分析信號的方法。微生物在滋生代謝過程中，培養(yǎng)基的電化學(xué)性質(zhì)如電流、電位等會發(fā)生相應(yīng)變化，所以可通過分析這些電化學(xué)參量的變化，實現(xiàn)對微生物的快速測定。在牛奶的檢測中常見的有還原試驗法；電導(dǎo)、阻抗法；生物傳感器法。還原試驗法避免了色素的生色靈敏度低、不能迅速測量的缺點。有的學(xué)者使用電阻抗技術(shù)快速檢測牛奶中的大腸菌群。電導(dǎo)、阻抗法的缺點是必須先做出標準曲線，需要時間長。應(yīng)用于乳品檢測的此類產(chǎn)品主要有英國的MALTHUS微生物分析儀和法國的Bactometer微生物監(jiān)測儀等。

3.3 免疫學(xué)檢測方法

免疫檢測的基本原理是抗原抗體反應(yīng)。不同的微生物有其特異的抗原，并能激發(fā)機體產(chǎn)生相應(yīng)的特異性抗體。在免疫檢測中，可利用單克隆抗體檢測微生物的特異抗原，也可利用微生物抗原檢測體內(nèi)產(chǎn)生的特異抗體，兩種方法均能判斷機體的感染狀況。運用于乳中致病菌的免疫學(xué)方法主要有免疫磁性分離技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（ELISA）、酶聯(lián)熒光免疫吸附技術(shù)（VIDAS）等。各種免疫學(xué)方法的基本過程是相同的，先要進行病原菌的富集培養(yǎng)，再對富集物進行免疫檢測和分析。前者需18～24h，甚至更長時間，而免疫檢測過程則僅需幾小時，甚至幾分鐘。因此可以采用免疫磁珠分離方法或免疫膜富集技術(shù)等減少樣品的富集時間。當(dāng)然，免疫學(xué)方法也有許多需要改進的方面，主要包括交叉反應(yīng)、假陽性多、靈敏度偏低。在英國，免疫磁性分離技術(shù)主要應(yīng)用于牛奶中大腸桿菌O157：H7的[6]監(jiān)測。而Tsai等[7]用ELISA對奶酪和酸牛奶中的雜色曲霉、多主枝孢、白地霉、卷枝毛霉和產(chǎn)黃青霉進行了檢測。

3.4 分子生物學(xué)方法

3.4.1 PCR技術(shù)

PCR是一種在體外快速擴增特異目標基因的技術(shù)。它可以在試管中建立反應(yīng)，獲得足夠數(shù)量的DNA拷貝。PCR歷史發(fā)展為3個階段：定性PCR（電泳法）、酶免法定量PCR、實時熒光定量PCR。定性PCR具有快速、靈敏、特異等優(yōu)點，可以克服傳統(tǒng)檢測方法的缺點和不足。但過程比較復(fù)雜；不能區(qū)分有活性和沒有活性的細菌；使用的染色劑溴化乙啶是致癌物質(zhì)，可能危及操作人員的健康。實時熒光定量PCR技術(shù)比定性PCR技術(shù)發(fā)明晚將近10年，相比定性PCR，它有如下突出優(yōu)點：熒光定量PCR反應(yīng)過程實時監(jiān)測、熒光定量重復(fù)性好、基因定量分析——穩(wěn)定性好、熒光檢測——濃度梯度試驗線性范圍寬、熒光定量在對數(shù)期進行定量分析等優(yōu)勢。實時熒光定量PCR技術(shù)采用國際通行的檢測標準進行乳品中阪崎腸桿菌的檢測。

2005年5月20日，由中國檢驗檢疫科學(xué)研究院和天津出入境檢驗檢疫局牽頭完成的《奶粉中阪崎腸桿菌檢測方法》行業(yè)標準通過審定。這項標準的出臺，解決了我國檢測嬰幼兒配方奶粉中阪崎腸桿菌無標準、無檢測方法的問題。另外，多部國家標準明確要求用PCR方法檢測阪崎腸桿菌、食品中致病菌等。如《中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準》SN/T1632.1—2005奶粉中阪崎腸桿菌檢驗方法；2006年國家出臺的《嬰幼兒配方乳粉生產(chǎn)許可證審查細則》中明確要求采用國際通行的“熒光PCR儀”作為出廠檢驗必備設(shè)備，此要求已成為乳品企業(yè)生產(chǎn)許可證核發(fā)的必要條件。

在學(xué)術(shù)研究方面，胡建華[8]等采用快速常規(guī)PCR和定量實時PCR相結(jié)合，對培養(yǎng)液中及牛奶陽性樣品中的志賀氏菌進行檢測，檢測敏感度可達到2 mL-1，檢出時間小于20 h。新建的PCR方法適用于快速、準確檢測牛奶中志賀氏菌的需要，具有較高的實用和推廠價值。呂艷[9]等人利用PCR技術(shù)可在5 h內(nèi)檢測牛奶中的金黃色葡萄球菌，最低檢出限度35 ng/μL。趙寧[10]等人采用過濾富集菌體后PCR技術(shù)來檢測原料乳中蠟樣芽胞桿菌。馬冬[11]等人利用PCR技術(shù)檢測的是乳品中大腸桿菌?？傮w來說，PCR檢測方法具有靈敏度高、特異性強、抗污染能力強（熒光PCR）、容易操作等特點（見表1）[12]。但PCR方法容易受到乳品成分（如蛋白）的干擾，抑制PCR反應(yīng)的順利進行。所以，乳品樣本的前期處理及富集增菌技術(shù)還需進一步的研究。

表13 種檢測方法的比較

3.4.2 ATP生物熒光技術(shù)

ATP生物熒光技術(shù)的原理[13]是ATP分子能量通過熒光酶復(fù)合物的作用轉(zhuǎn)變?yōu)楣?，熒光強度與ATP濃度在一定范圍內(nèi)呈線性相關(guān)，而ATP在生物活細胞內(nèi)的含量大致恒定，以此可推測被檢樣品中微生物數(shù)量。ATP生物熒光技術(shù)檢測乳制品中的細菌總數(shù)及特異性病原菌具有簡便、快速、靈敏等特點，在原料奶的驗收、乳制品貨架期預(yù)測及抗生素、細菌、噬菌體殘留的檢出等方面應(yīng)用前景廣闊。Samkutty等利用線性回歸方程和ATP值預(yù)測了原料乳中的菌落總數(shù)[14]。在衛(wèi)生監(jiān)測中，ATP生物熒光技術(shù)5 min即可檢出結(jié)果，其數(shù)據(jù)與平板計數(shù)法的結(jié)果相關(guān)性大于80%。

3.4.3 液相芯片技術(shù)

液相芯片技術(shù) （MASA）是一種全新微量分析技術(shù)。其原理是將流式細胞術(shù)與熒光標記檢測相結(jié)合，把針對不同目標分子的探針與不同熒光值的微球共價偶聯(lián)，然后使其與目標分子在懸液中特異性結(jié)合，通過熒光信號特異性檢測到目標分子[15]。其特點是高靈敏性、高準確度、重現(xiàn)性好、高通量多指標同步分析，對單孔內(nèi)多達100種不同的反應(yīng)同時進行檢測。其缺點是檢測成本昂貴，達不到低成本檢測的目的。陳昱[16]等人運用建立的液相芯片檢測體系對牛奶中志賀氏菌、沙門氏菌、大腸桿菌0157進行了檢測。液相芯片技術(shù)檢測致病細菌，綜合了PCR和核酸雜交的優(yōu)點，無需培養(yǎng)直接分析，在微生物定性檢測以及基因分型等方面獨具優(yōu)勢。

3.5 分析化學(xué)技術(shù)

隨著分析化學(xué)技術(shù)的日新月異,很多儀器分析手段和方法如高效液相色譜[17]（HPLC）、氣相色譜（GC）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）等，已顯示出了在微生物檢測中的潛力。這些方法不同于依賴微生物生物學(xué)特征的檢測方法，而是通過分析微生物的化學(xué)組成（生物標志物）來區(qū)分和鑒定微生物，開辟了檢測和鑒定微生物的新途徑。但在乳品有害微生物檢測中的應(yīng)用較少。

4 乳品中微生物檢測的發(fā)展方向

綜上所述，乳中微生物的檢測方法多種多樣，各有優(yōu)缺點，可以采用多種方法聯(lián)合使用的策略來提高檢測靈敏度和檢測效率。但是，乳品從源頭到消費者飲用經(jīng)歷原料驗收、運輸、生產(chǎn)、包裝、銷售等環(huán)節(jié)，任何環(huán)節(jié)都存在污染的風(fēng)險，確保全程實時檢測是乳品微生物檢測接下來的發(fā)展方向。

4.1 在線檢測

目前，在線檢測成為乳品中致病菌檢測的發(fā)展趨勢。在國外，超聲波技術(shù)、生物傳感器[5]和高效毛細管電泳分析技術(shù)已被應(yīng)用于乳品檢測及在線檢測[18]，這些方法具有測量快速、操作簡單和信號可控性等實時檢測特點。黃曲霉毒素的去毒及在線檢測技術(shù)是一項牛奶加工的關(guān)鍵技術(shù)，具有巨大的市場潛力和重大的社會效益，特別是牛奶中AFT的去除技術(shù)是國際上牛奶加工尚未完全攻克的技術(shù)。該技術(shù)產(chǎn)品具有國際競爭力。采用先進的生物工程技術(shù)利用生物酶研制AFT反應(yīng)器、生物傳感器和“自生”式免疫親和柱等系列產(chǎn)品，用于AFT的去毒和分析檢測?！白陨笔矫庖哂H和柱是國際上牛奶加工需要的關(guān)鍵技術(shù)。中國乳品致病菌的在線檢測技術(shù)與設(shè)備仍處在初級階段，多數(shù)企業(yè)還在采用傳統(tǒng)的檢測方法。在線新技術(shù)的研發(fā)和應(yīng)用將是我國乳品中致病菌檢測方法的未來發(fā)展趨勢。隨著科學(xué)技術(shù)和各個學(xué)科的交叉發(fā)展，在線檢測最終將徹底改變?nèi)橹兄虏【鷻z測的現(xiàn)狀和傳統(tǒng)的觀念，實現(xiàn)高效、優(yōu)質(zhì)、廉價的統(tǒng)一。

4.2 現(xiàn)場檢測

隨著社會的發(fā)展和人們生活水平的提高，食品檢測現(xiàn)場化、家庭化的呼聲越來越高。相應(yīng)地，對食品檢測儀器的小型化、智能化、集成化、便攜式的要求也越來越迫切。這些儀器的研制和生產(chǎn)，是今后乳品中微生物檢測技術(shù)的另一發(fā)展趨勢。當(dāng)前，學(xué)者們提出的構(gòu)建生物芯片及縮微芯片理念，將進一步面向現(xiàn)場和速測方面。

縮微芯片實驗是在一個芯片上包含了分析所具備的一切重要部分：樣品處理、反應(yīng)試劑、檢測器等。一些所謂芯片實驗室的技術(shù)已經(jīng)市場化，如基因芯片。芯片技術(shù)將越來越多地進入乳品類食品病原菌檢測技術(shù)領(lǐng)域，實現(xiàn)檢測系統(tǒng)的集成化、一體化。我國國家生物芯片中心等單位已開發(fā)并生產(chǎn)食源性致病菌檢測、食源性病毒檢測和獸藥殘留檢測的生物芯片技術(shù)平臺（儀器和試劑盒），未來的檢測儀器與計算機緊密結(jié)合，自動采集數(shù)據(jù)、處理數(shù)據(jù)，更科學(xué)、更準確地提供結(jié)果，實現(xiàn)采樣、進樣、結(jié)果一條龍，形成檢測的自動化系統(tǒng)。

將納米技術(shù)與生物傳感器技術(shù)相結(jié)合，檢測乳品中致病菌的方法在國外已有相關(guān)報道，而我國還未涉及。納米結(jié)構(gòu)通常是指尺寸在100 nm以下的微小結(jié)構(gòu)。像一個單一細胞膜一樣的納米傳感器將具有其他傳感器無法比擬的靈敏度和快速的響應(yīng)時間。生物傳感器的納米化，可使人們在市場上直接檢測食品成為可能[19]。

近年來發(fā)展迅速的電子鼻和電子舌等仿生技術(shù)和傳感器技術(shù)[20,21]，能夠快速反應(yīng)出被測樣品的整體特征信息，在乳制品品質(zhì)及貨架期監(jiān)控等方面的應(yīng)用研究異常活躍。目前，電子鼻在微生物方面的檢測針對不同的腐敗菌種類及其生長規(guī)律進行研究。針對高危險致病性微生物的檢測還有待于研究。

4.3 低成本檢測

現(xiàn)代檢測技術(shù)存在共性的問題：檢測成本高。昂貴的檢測儀器及試劑并不符合我國檢測行業(yè)的標準，也不符合我國國情，尤其是對基層食品檢測工作。我國農(nóng)村人口高達9億，農(nóng)村市場是乳品消費的一大主力。所以，農(nóng)村市場的乳品檢測監(jiān)測勢在必行。而昂貴的檢測成本對于基層食品檢測負擔(dān)太大，阻礙檢測工作的進行。而且，檢測技術(shù)的不斷進步，必然要求不斷降低產(chǎn)品成本，提高靈敏度、穩(wěn)定性和延長壽命。這些特性的改善也會加速檢測儀器現(xiàn)場化、商品化的進程。

5 結(jié)束語

乳品安全是一個重大的公共衛(wèi)生問題。研究和應(yīng)用先進的安全檢測技術(shù)，可有效監(jiān)控乳品中的危險因素，預(yù)防和控制食源性疾病的發(fā)生。乳品中各類微生物檢測方法各自表現(xiàn)出不同的優(yōu)缺點[22]：如傳統(tǒng)的增殖培養(yǎng)、生化試驗等方法，鑒定過程時間長；免疫學(xué)方法快速、靈敏度高，但容易出現(xiàn)假陽性、假陰性；VIDAS等雖然快速準確、通量大，但只能鑒定到屬，僅適用于初篩，而且費用頗高?；蛐酒⒌鞍踪|(zhì)芯片準確、通量大，但制作費用太高，并且菌種的選擇性富集培養(yǎng)仍屬研究重點[23]，不利于普及。

建立更靈敏、更有效、更可靠、更簡便的微生物檢測技術(shù)是保證乳品安全的迫切需求和乳品微生物檢測技術(shù)的發(fā)展趨勢。生物技術(shù)是21世紀最具活力的技術(shù)，隨著分子生物學(xué)各種檢測方法之間交叉發(fā)展、相互融合、聯(lián)合使用，必將為我國乳品生產(chǎn)構(gòu)建起一道有效的安全屏障。多種檢測技術(shù)以及各學(xué)科的交叉發(fā)展有望能解決上述需求。

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Introduction and the development direction on the detection technique of harmful micro-organisms in dairy products

ZHANG Shou-wen1，YIN Lei2，ZHOU Yu-ling2
（1.Heilongjiang Food and Drug Administration，Harbin 150020,China）
（2.College of Food Engineering，Harbin University of Commerce，Harbin 150076,China）

This paper,in terms of food safety,systematically reviews disadvantage of main high-hazard pathogens in dairy products and the historical process of the detection method,the detection technique of harmful micro-organisms in milk on current domestic and international,the direction of development of microbial detection techniques in milk.

dairy products；micro-organisms；detection technology；the development direction

TS252.1

B

1001-2230（2010）01-0035-04

2009-09-30

張守文（1956-），男，教授，主要從事食品科學(xué)，工程和食品安全管理方面的研究。