張洪俠，劉善云，周桂桐

●成果報(bào)告

耐力運(yùn)動對ApoE基因缺陷小鼠肝X受體a和三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1基因表達(dá)的影響

張洪俠1，2，劉善云1，周桂桐3

目的：觀察耐力運(yùn)動對ApoE基因敲除（ApoE-/-）小鼠肝臟肝X受體a（LXR-a）和三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1（ABCA1）基因表達(dá)的影響及其在抗動脈粥樣硬化中的作用。方法：將24只8周齡ApoE基因敲除小鼠隨機(jī)分為AS模型組和運(yùn)動干預(yù)組，每組12只，運(yùn)動組進(jìn)行14周跑臺訓(xùn)練，實(shí)驗(yàn)持續(xù)14周后，采用普通PCR法測定肝臟LXR-a及ABCA1mRNA表達(dá)；采用HE染色法觀察主動脈根部的病理變化。結(jié)果：運(yùn)動組與安靜組相比，LXR-a和ABCA1mRNA表達(dá)上調(diào)（P＜0.05），主動脈斑塊及內(nèi)膜損傷程度較對照組減輕。結(jié)論：耐力運(yùn)動通過增加LXR-a和ABCA1mRNA的表達(dá)，而發(fā)揮抗動脈粥樣硬化的作用。

耐力運(yùn)動；ApoE基因缺陷小鼠；動脈粥樣硬化；LXR-a；ABCA1

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是導(dǎo)致心臟病的首要原因，也是糖尿病和肥胖癥的一種常見并發(fā)癥，嚴(yán)重危害人們的生命和健康。它不僅是動脈自身的疾病，而且也是導(dǎo)致心肌梗塞、腦梗塞和肢體功能喪失的主要原因，是心腦血管病的主要病理基礎(chǔ)。近年研究表明，肝X受體（LXRs）與AS的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，并且得到大量研究證實(shí)[1－2]。肝X受體（LXRs）是核受體超家族的成員之一，因肝臟表達(dá)最豐富而命名。LXRs有二種亞型LXRa、LXRβ，其中LXRa與AS的發(fā)生密切相關(guān)。

運(yùn)動醫(yī)學(xué)界大量研究表明，運(yùn)動是防治AS的有效措施之一。但運(yùn)動究竟通過何種機(jī)制發(fā)揮抗AS的作用研究較少。本研究試圖通過觀察運(yùn)動對小鼠LXRα影響的研究來探討其抗AS的可能機(jī)制。目前國內(nèi)外對LXRs的研究仍集中在藥物及其激動劑對AS的影響方面，而結(jié)合運(yùn)動加以研究的還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谘芯磕土\(yùn)動對LXRα、ABCA 1表達(dá)的影響及其在防治AS中的作用，以進(jìn)一步闡明運(yùn)動抗AS的可能機(jī)制。

1 研究材料與方法

1.1 主要試劑及設(shè)備

TRIzol（Invitrogen，美國），RT試劑盒（invitrogen公司），PCR試劑盒（上海生物工程公司）。LXRα，ABCA1和β－Actin引物（上海生物工程公司合成），其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。垂直電泳儀及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（美國Bio－Rad），PCR儀（美國伯樂）等。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物及訓(xùn)練方案

選用24只雄性8周齡基因敲除小鼠，體重（20±2）g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物中心提供。小鼠按組分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水，飼以“西方類型”膳食（膽固醇含量為0.15%，脂肪含量為21%），實(shí)驗(yàn)期間，室內(nèi)溫度基本控制在（20～25）℃，濕度60%左右，每天定時通風(fēng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)取材

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，運(yùn)動組在末次訓(xùn)練48 h后和其對照組取材，打開胸腹腔，沖洗后，迅速取出小鼠心臟（包括主動脈弓）放置于4%的多聚甲醛中進(jìn)行固定后，20%蔗糖固定過夜，OCT包埋，－70℃保存，以備做冰凍切片；再迅速取出肝臟，放置于液氮中，－70℃保存，用于測定mRNA的表達(dá)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法及指標(biāo)的測定

1.4.1 小鼠主動脈竇典型動脈粥樣斑塊的結(jié)構(gòu)觀察（HE染色）采用小鼠冰凍切片的蘇木素－伊紅（hetamoxylin－eosin，HE）染色，取小鼠主動脈竇冰凍切片，蒸餾水沖洗6 min，蘇木素染色2 min，蒸餾水多次沖洗，伊紅染色1 min，95%酒精分色脫水3次，100%酒精2次各2 min脫水，二甲苯脫水2次各5 min，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.4.2 逆轉(zhuǎn)綠聚合酶鏈反應(yīng)法測定LXR-a和ABCA1mRNA的表達(dá) 采用Trizol試劑抽提肝細(xì)胞總RNA，與紫外分光光度計(jì)下測定260 nm和280 nm波長A值兩者比值為1.6～1.8，表示RNA純度高，并于1%瓊脂糖凝膠電泳（1×TAE緩沖液）鑒定RNA完整性。將RNA稀釋到1 μg/μL，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Qiagen公司）合成cDNA。采用Primer Express 2.0軟件設(shè)計(jì)LXRα、ABCA1和β－actin基因的上游和下游引物。RNA逆轉(zhuǎn)錄按試劑盒進(jìn)行，生成的cDNA按以下反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR總反應(yīng)體積25 μL，模板1 μL，上下游引物各1 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。以β－actin為內(nèi)參照進(jìn)行PCR擴(kuò)增.PCR擴(kuò)增引物及產(chǎn)物長度為：（1）LXRα：上游引物5'－AGGGATAGGGTTGGAGTCAGC－3'，下游引物5TGAGCCTG TTCCTCTTCTTGC3，擴(kuò)增片段為402。ABCA1上游引物5－CCT GTT TCC GTT ACC CGA CTC－3，下游引物5－ACA GGC GAG CCA CAA TGG－3，擴(kuò)增片段 557。Beta－Actin上游引物5CCATCTACGAGGGCTATGCT3，下游引物5CAAGAAGGAAGG CTGGAAAA3，擴(kuò)增片段311 bp。LXRα、ABCA1及β－actin擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，57℃退火1 min，72℃延伸1 min，30次循環(huán)后，再行72℃延伸7 min.取PCR產(chǎn)物5 μL于瓊脂糖凝膠中電泳，用全自動凝膠分析系統(tǒng)灰度掃描分析，并計(jì)算LXRα/β－actin和ABCA1/β－actin值比，代表LXRαmRNA和ABCA1mRNA的表達(dá)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均有SPSS統(tǒng)計(jì)軟件（SPSS16.0）處理，數(shù)據(jù)以均值±S表示，數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布時，采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2結(jié) 果

2.1 小鼠主動脈病理形態(tài)的變化

主動脈竇切片經(jīng)HE染色，顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，主動脈管壁薄厚不均，內(nèi)膜增厚，內(nèi)膜下間隙增寬，可見大量的泡沫細(xì)胞，也可見纖維期病變，有的纖維帽較薄，纖維帽下為大量的粉染的無定形和針狀空隙（膽固醇結(jié)晶），脂質(zhì)核心較大，與管壁粘附不緊密，有脫落現(xiàn)象。中膜平滑肌受壓，萎縮，排列紊亂。有內(nèi)彈力板斷裂、甚至消失現(xiàn)象。但與模型組相比，運(yùn)動組小鼠主動脈病變相對較輕，AS斑塊面積相對較少，且多處在病變的早期階段。表明耐力運(yùn)動有效地抑制ApoE－/－小鼠AS病變的發(fā)生發(fā)展（見圖1）。

2.2 各組小鼠主動脈LXRa 和ABCA1的變化

本研究顯示，經(jīng)14周耐力運(yùn)動訓(xùn)練后，運(yùn)動組小鼠肝臟LXRaRNA和ABCA1mRNA表達(dá)水平明顯高于模型組（P＜0.05），提示運(yùn)動上調(diào)了LXRa mRNA和ABCA1mRNA表達(dá)（見表1）。

表1 耐力運(yùn)動對肝臟LXRaRNA和ABCA1mRNA表達(dá)影響的比較（±S）

表1 耐力運(yùn)動對肝臟LXRaRNA和ABCA1mRNA表達(dá)影響的比較（±S）

注：＃與模型組相比P＜0.05。

組別 LXRa（灰度值） ABCA1（灰度值）C組 0.189±0.016 0.339±0.047 E組 0.335±0.07＃ 0.595±0.164＃

3 討 論

近年來，有關(guān)AS干預(yù)手段及其機(jī)制的研究日益受到關(guān)注。本研究對運(yùn)動干預(yù)ApoE－/－小鼠AS形成及作用機(jī)制方面進(jìn)行深入探討，并獲得一些有益的結(jié)果。

AS病因復(fù)雜，其中膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)與AS發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系[7]，而LXRa和ABCA1是實(shí)現(xiàn)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)的兩個關(guān)鍵調(diào)控者。LXRa為配體依賴性核受體，必須與相應(yīng)的配體結(jié)合后才能被激活[8－9]，其最有效的內(nèi)源性配體是膽固醇的衍生物即氧化固醇。LXRa作為維持細(xì)胞內(nèi)膽固醇相對穩(wěn)定的關(guān)鍵感受器，它通過調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)進(jìn)而影響膽固醇的代謝與轉(zhuǎn)運(yùn)的多個環(huán)節(jié)[10]，ABCA1是典型的LXRa靶基因，受其調(diào)控。在ABCA1啟動子區(qū)域有LXR反應(yīng)元件[11]，它以ATP為能源，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇和磷脂的流出，在膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)和高密度脂蛋白（HDL）生成的起始步驟中起重要作用[12]，被稱作膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)的守門人。激活的LXRa通過調(diào)控其下游靶基因ABCA1的表達(dá)，發(fā)揮抗AS的作用。本研究采用易于形成AS的ApoE－/－小鼠復(fù)制AS模型，以便探討運(yùn)動、LXRa與AS之間的關(guān)系。

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，8周齡ApoE－/－小鼠經(jīng)“西方類型”膳食喂養(yǎng)14周后，主動脈根部已形成典型的AS斑塊。AS模型組主動脈內(nèi)膜明顯增厚，內(nèi)皮下間隙增寬，可見大量泡沫細(xì)胞形成的脂紋期以及纖維化期病變。而經(jīng)過14周耐力運(yùn)動干預(yù)后ApoE－/－小鼠AS的形成及病變程度較模型組明顯減輕，大多停留在病斑的早期階段。此外，袁凌燕[13]等研究也發(fā)現(xiàn)，8周齡ApoE－/－小鼠經(jīng)“西方類型”膳食喂養(yǎng)至20周時，實(shí)驗(yàn)動物形成典型的AS病變，而經(jīng)12周有氧運(yùn)動后，運(yùn)動組AS斑塊面積較對照組顯著減少。提示有氧運(yùn)動有效地抑制或延緩了ApoE－/－小鼠AS的形成。

本研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動組LXRα和ABCA1灰度值明顯高于模型組（P＜0.05），說明運(yùn)動作為一有效手段提高了LXRα和ABCA1基因表達(dá)，結(jié)合兩組實(shí)驗(yàn)動物主動脈病理形態(tài)的變化可推測，運(yùn)動有效抑制AS發(fā)生發(fā)展可能是通過上調(diào)LXRα和ABCA1基因表達(dá)而發(fā)揮抗AS作用。

耐力運(yùn)動究竟是通過何種途徑來影響LXRα基因表達(dá)，目前尚未見到相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。作者認(rèn)為可能與以下機(jī)制有關(guān)：其一，由于運(yùn)動增加膽固醇流出[14]產(chǎn)生大量的氧化甾醇，氧化甾醇是LXRα的天然配體，LXRα與配體結(jié)合后被活化，由于大量的LXRα被活化，進(jìn)而激活其下游靶基因ABCA1的表達(dá)，增強(qiáng)膽固醇的逆轉(zhuǎn)運(yùn)過程，從而降低AS的發(fā)生發(fā)展；其二，耐力運(yùn)動促進(jìn)LXRα基因表達(dá)可能與運(yùn)動加快血流速度、增加血管壁切應(yīng)力有關(guān)。管壁切應(yīng)力增加可通過過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）、甾醇27－羥化酶（sterol27－h(huán)ydroxylase，CYP27）依賴方式上調(diào)LXRα及其部分靶基因的表達(dá)，從而起到保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用。由此可見，耐力運(yùn)動可能通過增加氧化固醇含量、加快血流速度、提高血管壁剪切力等方式，增加LXRα基因表達(dá)，從而延緩AS病變的發(fā)生與發(fā)展。

4結(jié) 論

14周耐力運(yùn)動能有效地增加ApoE－/－小鼠肝臟LXRα和ABCA1mRNA表達(dá)，從而發(fā)揮抗動脈粥樣硬化的作用。

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Effect of Endurance Exercise on LXRa andABCA1 gene expression in Apoe-Deficient Mice and Its Intervention from Atherosclerotisis

ZHANG Hongxia1，LIU Shanyun2，ZHOU guitong3
（1.Dept of health&exercise，Tianjin University of Sport，Tianjin 300381，China；2.Dept.of Clinical Training，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；3.Dean's office，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

Objective：To investigate the effects of endurance training on expressions of LXRα and ABCA1in in ApoE－deficient mice and to explore the relation of LXRα with Atherosclerosis.Eighteen 8－week old ApoE－deficient mice were selected and divided into atherosclerosis model group and exercise group randomly.There were twelve mice in each group.Mice of exercise group were trained on treadmill for fourteen weeks.The LXRα and ABCA1mRNA of liver were determined by reverse transcriptase polymerase chain reaction（PCR）.The pathological change were determined by HE staining.Results：The expression of LXRα and ABCA1mRNA were significantly increased（P＜0.05）in ApoE－deficient mice with endurance exercise.The degree of lesion in aorta wall and tunica intima was lighter in ApoE－deficient mice with endurance exercise.Conclusions：The present study demonstrated that endurance exercise may contribute to its anti－atherosclerosis function by significantly increasing LXRα and ABCA1 mRNA.

enduranceexercise；ApoE－deficient mice；atherosclerosis；LXRα；ABCA1

G 804.7

A

1005-0000（2010）06-0486-03

2010-09-09；

2010-11-18；錄用日期：2010-11-22

天津市科技計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號：08JCYBJC06000）

張洪俠（1978-），女，安徽宿州人，助理實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)檫\(yùn)動與健康促進(jìn)。通訊作者：劉善云（1958-），女，天津市人，教授，博士，研究方向?yàn)檫\(yùn)動與健康促進(jìn)。

1.天津體育學(xué)院健康與運(yùn)動人體科學(xué)系，天津300381；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)臨床實(shí)訓(xùn)教學(xué)部，天津300193；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)教務(wù)處，天津300193。

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨即分為兩組，分別為模型組（C組）和運(yùn)動組（E組），每組12只，各實(shí)驗(yàn)組間無顯著性差異，運(yùn)動組進(jìn)行中等強(qiáng)度的跑臺訓(xùn)練：跑臺速度為13 m/min，每天1 h。以1周為1單元，每周訓(xùn)練5次，參考ApoE－/－小鼠運(yùn)動量[3－6]。