張明軍

●成果報告

運動對RBP4誘導的胰島素抵抗大鼠骨骼肌PI3-K表達的影響

張明軍

目的：研究運動對RBP4誘導的胰島素抵抗大鼠骨骼肌PI3-K表達的影響。方法：8周齡雄性SD大鼠給予重組RBP43μgg-1體重腹腔注射，12小時注射一次，持續(xù)注射3周。設RBP4+運動組（RE）、RBP4安靜組（RR）和正常安靜對照組（C），RE組予3周無負重游泳訓練，60 min/天. ELISA、液閃計、免疫組化和免疫印跡法分別檢測血清RBP4，胰島素抵抗指數(shù)HOMA-IR、葡萄糖攝取率和骨骼肌PI3-K表達。結果：RBP4注射組血清RBP4和HOMA-IR顯著高于未注射RBP4的正常安靜對照組，葡萄糖攝取率顯著低于正常安靜對照組；RE組血清RBP4和HOMA-IR顯著低于RR組，葡萄糖攝取率顯著高于RR組。RE組骨骼肌細胞PI3-K蛋白表達顯著高于RR組。結論：游泳運動能夠增加RBP4誘導的胰島素抵抗大鼠骨骼肌PI3-K表達，促進葡萄糖攝取，改善胰島素抵抗。

運動；視黃醇結合蛋白4；胰島素抵抗；磷酸肌醇-3-激酶

視黃醇結合蛋白4（RBP4）是一類特異性結合視黃醇的蛋白質，主要由脂肪細胞分泌[1]。研究發(fā)現(xiàn)，RBP4是導致胰島素抗性的脂肪因子，在胰島素抗發(fā)展過程中起到一個關鍵作用，具有胰島素抗性的小鼠和患有肥胖和2型糖尿病的病人體內，血清RBP4的水平是升高的[2]。升高的RBP4水平可以用于評價胰島素抵抗程度，并與心血管危險因子的關系密切[3]。研究顯示，運動訓練能夠降低不同年齡研究對象的RBP4水平[3-4]，提示運動可以通過降低RBP4水平，提高胰島素敏感性。

前期對運動改善RBP4誘導的胰島素抵抗機制進行探索發(fā)現(xiàn)，RBP4抑制了胰島素信號傳導的關鍵蛋白胰島素受體（IR）和胰島素受體底物1（IRS-1）的蛋白表達和磷酸化，進行8周游泳運動后，IRS-1的磷酸化抑制被解除，葡萄糖攝取率提高[5]。在胰島素信號轉導通路中，具有酪氨酸激酶活性的跨膜受體胰島素受體與胰島素結合后，自身發(fā)生自磷酸化，使胰島素受體底物的酪氨酸殘基磷酸化，使酪氨酸激酶自身激活，活化的受體酪氨酸激酶殘基為效應蛋白提供了附著點，募集眾多重要的效應蛋白，將信號傳遞給細胞內不同的信號傳遞通路，其中包括磷酸肌醇-3-激酶（PI-3-kinase）通路，胰島素介導的許多生物學效應是由該通路介導的。本文采用重組RBP4注射活體大鼠，獲得高RBP4誘導的胰島素抵抗大鼠模型，觀察運動后胰島素抵抗和骨骼肌細胞PI3-K的表達變化，進一步深入探討運動影響RBP4誘導的胰島素抵抗機制。

1 研究材料與方法

1.1 材 料

胰島素（Sigma-Aldrich）、2-Deoxy-D-[I-3H]-glucose（Sigma-Aldrich）、抗PI3-K多克隆抗體（ProSpec）以及相應的第二抗體、RBP4ELISA試劑盒（Biosource）、胰島素放射免疫試劑盒（Biogenesis）、重組RBP4（Alexis）均購自廈門慧嘉生物技術公司。

1.2 方 法

1.2.1 重組RBP4注射與運動方案 雄性SD大鼠18只，8周齡，體重180～210 g，隨機分為RBP4+運動組（RE）12只、RBP4安靜組（RR）6只，2組大鼠給予重組RBP4腹腔注射[2]，3μg/g體重，12小時注射一次，持續(xù)注射3周。RE組大鼠同時進行游泳訓練，按照Ploug方法[6]訓練3周，RE組6只大鼠同時在直徑47 cm內壁光滑的塑料桶內進行游泳訓練，水深60 cm，水溫保持在35℃，游泳訓練時間為晚上19點；大鼠10 min/天適應性游泳訓練2天，第3天后每天無負重持續(xù)游泳60 min，每周訓練5天，周六、周日休息，持續(xù)3周。訓練早期大鼠不適應，出現(xiàn)反復下沉和溺水傾向時，撈出休息，然后補足訓練時間；出現(xiàn)大鼠抱團、漂浮現(xiàn)象時予以驅趕，使之處于持續(xù)運動狀態(tài)，保證訓練效果。安靜對照組大鼠浸水后撈出。游泳結束后干毛巾擦拭，電吹風吹干。雄性SD大鼠6只為正常安靜對照組（C）。

1.2.2 血清RBP4和胰島素抵抗指數(shù)的檢測 RBP4的測定采用雙抗體夾心酶標免疫分析法。胰島素測定采用放射免疫分析法。評價胰島素敏感性的方法采用穩(wěn)態(tài)模式評估法，該方法是假定肝臟和外周組織的胰島素抵抗相等，按血葡萄糖和胰島素在不同器官（包括胰腺、肝和周圍組織）的相互影響而建立的數(shù)學模型。此模型的計算公式涉及空腹血糖和空腹胰島素，即穩(wěn)態(tài)模型的胰島素抵抗指數(shù)（HOMA－IR）=空腹胰島素（國際單位/ L）×以空腹葡萄糖（mmoL/L）/22.5。

1.2.3 骨骼肌細胞葡萄糖攝取率和PI-3K表達的檢測 骨骼肌細胞葡萄糖攝取率檢測。第3周運動后，6只免疫組化法檢測PI3－K表達的大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉，心臟取血，4%多聚甲醛灌注后取腓腸肌，進行24小時外固定。6只免疫印跡法檢測PI3－K表達的大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉，心臟取血，斷頭處死后分離腓腸肌細胞，25 mmol/L 2－Deoxy－D－[I－3H]－glucose分別孵育各組骨骼肌細胞，之后，細胞轉入Kerbs－Ringers液，分別添加胰島素（10U/L）或不予胰島素孵育24 h，液閃計數(shù)儀測定骨骼肌細胞葡萄糖攝取率。各組內同比重復2次，實驗共重復5次。

免疫組化法檢測腓腸肌細胞PI－3K的表達。HE常規(guī)染色：制作4 μm的石蠟切片，脫蠟，Harris蘇木素液染色，脫水、透明、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察：細胞核呈藍色胞漿呈紅色。免疫組織化學染色：脫蠟，檸檬酸鹽緩沖液（pH＝6.0）高溫高壓熱修復抗原，3%過氧化氫溶液浸泡10 min阻斷內源性過氧化物酶，PBS振洗。l∶20正常二抗血清室溫10 min封閉，甩去血清后加一抗（1∶200），置濕盒內37℃60 min，PBS清洗，擦片后加二抗（試劑盒配置），置濕盒內37℃孵育10 min，清洗，加入2滴DAB顯微鏡下觀察，顯色3～5 min，流水沖洗10～15 min終止顯色。脫水、透明、固封。顯微鏡下觀察：核紫藍色，陽性呈棕黃色，胞漿或胞膜染色陽性，以低倍顯微鏡在每張切片上隨即選取5個視野，數(shù)碼成像系統(tǒng)攝片，IPP5.0（美國）專業(yè)圖像分析系統(tǒng)分析染色陽性物質，測定累計光密度（intergrated optical density，IOD）。

免疫印跡法檢測PI3－K的表達。DNP離心分離骨骼肌細胞，細胞分別經(jīng)PBS洗2次，使用細胞溶解液消化1 h，離心15 min（4℃、12 000 g），采取上清液放入－80℃中保存?zhèn)溆?。West bloting法測定PI－3K蛋白表達，100 μg細胞溶解物SDS－PAGE蛋白分離，然后轉移至硝酸纖維素膜。在室溫用5%低脂奶粉PBS液封膜3 h。加入抗PI3－K抗體（工作濃度1∶4 000）4℃孵育過夜，洗滌后加入相應辣根過氧化酶標記的Ⅱ抗（工作濃度1∶5 000）分別孵育1 h，洗膜方法同前。充分洗滌后與ECL（增強化學發(fā)光劑，英國Amersham）反應，即刻與KadakX－Omat底片曝光洗片后用LeicaQ550－IW圖像分析儀（德國）進行掃描，測定光密度，進行定量分析。

1.3 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)以SPSS16.0進行統(tǒng)計，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（X± S）表示，Kolmogorov－Smirnov檢驗數(shù)據(jù)的正態(tài)分布，組間進行方差分析，采用LSD檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義，P＜0.01為差異具有顯著統(tǒng)計學意義。

2結 果

2.1 血清RBP4和胰島素抵抗指數(shù)變化

3周后，RE組和RR組大鼠血清RBP4水平顯著高于C組（P＜0.01）；RE組大鼠血清RBP4水平顯著低于RR組（P＜0.01）；RE組和RR組大鼠HOMA－IR顯著高于C組（P＜0.01）；RE組大鼠HOMA－IR顯著低于RR組（P＜0.01）（見表1）。

表1 血清RBP4和胰島素抵抗指數(shù)變化Tab 1 Changes in serum RBP4 and HOMA-IR of rats（n=6）

2.2 骨骼肌細胞葡萄糖攝取率變化

3周后，RE組和RR組大鼠骨骼肌基礎狀態(tài)下（未添加胰島素）和胰島素刺激狀態(tài)下的葡萄糖攝取率均顯著低于C組（P＜0.01）；與RR組相比，RE組骨骼肌基礎狀態(tài)下（未添加胰島素）和胰島素刺激狀態(tài)下的葡萄糖攝取率顯著增加（P＜0.01）（見表2）。

表2大鼠骨骼肌葡萄糖攝取率變化Tab 2 Changes in glucose uptake rate of rats skeletal muscle（n=6）RBP4+運動組（RE）RBP4安靜組（RR） 正常安靜對照組（C）基礎狀態(tài) 3.3±0.2ab 1.7±0.3a 5.8±0.4胰島素刺激狀態(tài) 5.5±0.1ab 3.8±0.2a 8.1±0.4

2.3 骨骼肌細胞PI3-K的表達變化

免疫組化染色結果顯示PI3－K于骨骼肌細胞漿中表達，呈棕黃色陽性顆粒，C組骨骼肌細胞漿內見大量棕黃色陽性顆粒，RE組骨骼肌漿內見比較明顯棕黃色陽性顆粒，RR照組僅見少量棕黃色陽性顆粒分布（見圖1）。3周后，RE組和RR組大鼠骨骼肌PI3－K陽性染色累計光密度均值均顯著低于C組（P＜0.01）；與RR組相比，RE組骨骼肌PI3－K陽性染色累計光密度均值顯著增加（P＜0.01）（見圖2）。

免疫印記結果顯示：3周后，RE組和RR組大鼠骨骼肌基礎狀態(tài)下（未添加胰島素）和胰島素刺激狀態(tài)下PI3－K蛋白表達均顯著低于C組（P＜0.01）；與RR組相比，RE組骨骼基礎狀態(tài)下（未添加胰島素）和胰島素刺激狀態(tài)下PI3－K蛋白表達顯著增加（P＜0.01）（見圖3）。

圖2 大鼠骨骼肌PI3-K的表達變化Fig 2 Protein expression of PI3-Kin rats skeletal muscle

圖3 大鼠骨骼肌基礎和胰島素刺激狀態(tài)下PI3-K的表達變化Fig 3 Protein expression of PI3-Kin rats skeletal muscle after incubalation with orwithout insulin.

3 討 論

本研究結果顯示，大鼠經(jīng)過RBP4注射3周后，RE組大鼠和RR組大鼠血清RBP4水平和HOMA－IR水平顯著高于未注射RBP4的C組大鼠。對2組RBP4注射大鼠的進一步分析發(fā)現(xiàn)，RE組大鼠血清RBP4水平顯著低于RR組，較RR組下降30%；RE組大鼠HOMA－IR也顯著低于RR組，較RR組下降44%，結果與以往運動對RBP4影響的研究一致[3－4，7]。胰島素抵抗不僅是2型糖尿病的發(fā)病基礎，還是代謝綜合征（糖尿病、肥胖、高血壓病、動脈粥樣硬化、脂肪肝等疾病）的共同的病理基礎。目前的研究中常用的胰島素抵抗的評價方法包括：葡萄糖耐量試驗（OGTT）、HOMA－IR、胰島素敏感性指數(shù)（ISI）和胰島素釋放試驗（AIC）等，除了正常血糖高胰島素鉗夾試驗這一“金標準”外，其它方法在評價胰島素抵抗時各有不足之處。本研究采用HOMA－IR作為胰島素抵抗的評價指標，其數(shù)學模型的理論依據(jù)是肝臟和胰島β細胞在調節(jié)血糖和胰島素濃度時存在一個負反饋環(huán)路。該方法與正常血糖高胰島素鉗夾試驗比較，具有簡單方便，易于操作的特點，自Matthews等首次將HOMA－IR運用于胰島素抵抗的評價后便成為很多研究中最為常用的指標之一[8]。

胰島素能夠提高組織對葡萄糖的攝取率，機制是胰島素與靶細胞的胰島素信號蛋白相互作用，最終能夠增加葡萄糖轉運體從細胞內池向細胞膜的運動[9]。胰島素在不同的組織、細胞中通過復雜的信號級聯(lián)放大作用發(fā)揮不同的生理作用[10]。胰島素與IR結合，激活IR的酪氨酸蛋白激酶的活性，導致IR、IRS1、IRS2、src同源性/膠原蛋白和pp60/IRS3的酪氨酸磷酸化[10]，隨后，酪氨酸磷酸化的底物借助SH2結構域募集磷脂酰肌醇－3激酶（PI3－K）的P85亞單位和生長因子受體結合蛋白（GRB），PI3－K酶的激活導致了包含葡萄糖轉運體4（GLUT4）的囊泡的轉位增加，從而增加骨骼肌和脂肪細胞的葡萄糖攝取[11]。本研究中大鼠經(jīng)過RBP4注射3周后，與C組相比，RE組和RR組大鼠均出現(xiàn)胰島素抵抗，葡萄糖攝取率均比安靜正常大鼠顯著下降；對RBP4注射后的大鼠進行運動干預后發(fā)現(xiàn)，RE組大鼠骨骼肌基礎和胰島素刺激狀態(tài)下的葡萄糖攝取率顯著高于RR組，基礎和胰島素刺激狀態(tài)下的葡萄糖攝取率較RR組分別增加94%和45%。綜合上述研究結果可以判定：3周游泳運動能夠緩解RBP4誘導的胰島素抵抗，增加骨骼肌的葡萄糖攝取，但是具體機制尚不明確。

PI3－K是由調節(jié)亞基和催化亞基組成的異源二聚體，P85調節(jié)亞基是多種細胞內激酶和受體酪氨酸激酶的磷酸化底物，能夠通過本身SH2結構域與許多酪氨酸激酶種磷酸化的酪氨酸殘基結合，P85－酪氨酸蛋白激酶之間可以通過包括IRS－1在內的適配蛋白發(fā)揮作用。在組成PI3－K家族的成員中，ClassIPI3－Ks是由兩個亞類IA和IB組成，分別傳導來自酪氨酸激酶和G蛋白耦聯(lián)受體的信號。PI3－K催化磷脂酰肌醇在D3位的磷酸化，使底物PIP2轉化為PIP3。P85α、β、γ 3種不同基因編碼中P85α可能對P110亞基活性有負性調節(jié)作用，該調節(jié)功能的發(fā)揮與P85的兩個SH2結構域、一個位于蛋白內部與P110結合的結構域、一個位于氨基酸末端的SH3結構域和BCR同源結構域有關，PI3－K的另外兩個剪切異構體P55α和P50α由于缺失SH3結構域和BCR同源結構域，催化活性超過P85α。P110亞基也由3種基因編碼（α、β、γ），還有相同結構域，PI3－K家族的成員中ClassII和ClassIII可能與抗原遞呈和細胞毒作用有關。P13－K可被生長因子、細胞因子和胰島素等細胞外信號刺激激活。P13－K的靶蛋白是蛋白激酶B（PKB）/Akt，在磷脂酰肌醇依賴的蛋白激酶（PDK）的協(xié)同作用下，P13－K激活產物導致Akt從胞漿轉位到質膜，并促進Akt的Ser473和Thy308位點磷酸化，激活的Akt主要通過哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、糖原合成酶激酶－3（GSK－3）等下游底物磷酸化而發(fā)揮廣泛的生物學效應[12－13]。為了進一步探索運動改善RBP4誘導的胰島素抵抗機制，我們挑選胰島素信號傳導通路中的關鍵酶PI3－K為觀察指標，分別采用免疫組化和免疫印跡的方法對骨骼肌細胞內PI3－K的表達進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)：RBP4注射3周后，RE組和RR組大鼠的PI3－K表達均比C組顯著下降；運動干預后，RE組大鼠骨骼肌內PI3－K的表達量則較RR組顯著增加，隨后的免疫印跡結果也與免疫組化一致。

胰島素是重要的P13－K/AKt/mTOR信號通路的細胞外信號刺激激素，而運動可以增加骨骼肌細胞對胰島素的敏感性，通過激活P13－K/AKt/mTOR信號轉導途徑增加葡萄糖的吸收和利用，調節(jié)血糖平衡。RBP4是一種脂肪因子，作用廣泛，對于鼠骨骼肌細胞的胰島素信號傳導也會產生影響，研究顯示，RBP4通過影響鼠骨骼肌細胞IRS1和PI3－K酶抑制胰島素信號的傳導，RBP4注射21天后，小鼠骨骼肌胰島素刺激狀態(tài)下的PI3－K的活性下降了34%[2]。結合本研究結果可以推斷：PI3－K可能是胰島素信號傳導過程中受到RBP4影響的信號蛋白之一，其蛋白表達量的改變可能使下游蛋白的表達以及磷酸化發(fā)生變化，最終導致骨骼肌細胞生物學效應發(fā)生變化，葡萄糖攝取率的降低就是這些變化中的一種，或許可以作為解釋RBP4誘導骨骼肌細胞產生胰島素抵抗的機制之一。

經(jīng)過3周游泳運動干預后，RE組大鼠PI3-K蛋白表達顯著高于RR組，增加幅度達到74%，說明運動部分增加了被RBP4抑制的PI3-K蛋白表達，通過影響P13-K/AKt/mTOR信號通路，骨骼肌的葡萄糖攝取功能也得以改善，胰島素抵抗程度也相應減輕。由于胰島素信號傳導的途徑比較復雜，涉及數(shù)量和種類繁雜的信號蛋白，本研究僅僅以P13-K/AKt/mTOR信號通路中的PI3-K為觀察指標，試圖探索運動影響RBP4誘導的胰島素抵抗機制，即使發(fā)現(xiàn)了運動與RBP4誘導的胰島素抵抗骨骼肌細胞PI3-K之間的聯(lián)系，也只能作為一種可能的解釋，仍然需要對其它蛋白和信號通路做深入研究，才有可能全面揭示運動改善胰島素抵抗的機制。

[1]Quadro L，Blaner W S，Salchow D J，et al.Impaired retinal function and vitamin A availability in mice lacking retinol[J].J EMBO，1999，17（18）：4 633-4 644.

[2]Yang Q，GrahamTE，Mody N.Serumretinol binding protein 4 contributes to insulin resistance in obesity and type 2 diabetes.Nature， 2005，436（21）：356-362.

[3]Graham T E，Yang Q，Bluher M.Retinol-Binding Protein 4 and Insulin Resistance in Lean，Obese，and Diabetic Subjects[J].NEJM，2006，354：2 552-2 563.

[4]LimS，Choi S H，Jeong I K，et al.Insulin-sensitizing effects of exercise on adiponectin and retinol-binding protein-4 concentrations in young and middle-aged women[J].J Clin Endocrinol Metab，2008，93（6）：2 263-2 268.

[5]張明軍.RBP4對游泳訓練大鼠脂肪細胞IR和IRS-1蛋白表達和磷酸化的影響[J].天津體育學院學報，2010，25（1）：38-40.

[6]Ploug T，Stallknecht B M，Pedersen O.Effect of endurance training on glucose transport capacity and glucose transporter expression in rat skeletal muscle.AmJPhysiol，1990，259E：778-784.

[7]ReinehrT，Stoffel-WagnerB，RothCL.Retinol-bindingprotein 4 and its relation to insulin resistance in obese children before and after weight loss[J].J Clin Endocrinol Metab，2008，93（6）：2 287-93.

[8]Matthews D R，Hosker J P，Rudenski A S，et al.Homeostasis model assessment insulin resistance and β-cellfunction from fasting plasma glucose andinsulin concentrations in man[J].Diabetes，1985，25：1 154-1 161.

[9]Kwiecinski A，Nowak P.Effect of prenatal manganese intoxication on glucose uptake in the brain of ratslesioned asneonateswith 6-hydroxydopamine[J].Pharmacol Rep，2009，61（3）：558-563.

[10]Cheatham B，Kahn CR.Insulin Action and the Insulin Signaling Network[J].Endoc Rev，1995，16（2）：117-142.

[11]Lee J，Pilch P F.The insulin receptor：structure，function，and signaling[J].AmJ Physiol，1994，266：c319-c334.

[12]Cantley LC.The Phosphoinositide 3-Kinase Pathway[J].Science，2002，296：1 655-1 657.

[13]Vanhaesebroeck B，Waterfield M D.Signaling by distinct classes of phosphoinositide 3-kinases[J].Expl Cell Res，1999，253：239-254.

Effects of Exercise on PI3-K Expression of Skeletal Muscle in RBP4-induced Insulin Resistance Rats

ZHANG Mingjun
（School of PE and Sports Science，F(xiàn)ujian Normal University，F(xiàn)uzhou 350007，China）

Objective：To study the effects of exercise on PI3-K expression of skeletal muscle cells in RBP4-induced insulin resistance rats.Methods：8-week-old SD male rats model established by intraperitoneal injection with Recombination RBP4 3μgg-1body weight，2 times per day for 3 weeks.Model rats were divided into RBP4+swimming group（RE），RBP4+rest group（RE），and normal control group（C）.RE group rata swam three weeks without load，60 min per day.ELISA，fluid flash counter，IHC and western blotting were used to detect serum RBP4，HOMA-IR，glucose uptake rate and PI3-K expression，respectively.Results：Serum RBP4 and HOMA-IR increased more in RBP4 intraperitoneal injection exercise groups than normal control group，respectively.Non insulin-stimulated and insulin-stimulated glucose uptake rat decreased more in RBP4 intraperitoneal injection exercise groups than normal control group，respectively.Serum RBP4 and HOMA-IR decreased more in RE group than RR group，respectively.Non insulin-stimulated and insulin-stimulated glucose uptake rat increased more in RE group than RR group，respectively.PI3-K expression increased more in RE group than RR group.Conclusion：Exercise could increase PI3-K expression of skeletal muscle cells in RBP4-induced Insulin Resistance Rats，promote glucose uptake rat and improve insulin resistance.

exercise；retinal-binding protein-4；insulin resistance；PI3-K

G 804.7

A

1005-0000（2010）06-0482-04

2010-09-15；

2010-11-09；錄用日期：2010-11-15

福建省教育科學“十一五”規(guī)劃課題（項目編號：FJI10-050）；福建省教育廳科技課題（項目編號：JA10229）；莆田學院教育教學改革課題（項目編號：JG201019）

張明軍（1968-），男，安徽滁州人，講師，在讀博士研究生，研究方向為運動人體科學。

福建師范大學體育科學學院，福建福州350007。