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低聚原花青素對1型糖尿病小鼠血脂代謝和胰島功能的影響

2009-12-02 02:12涂獻玉長江大學(xué)醫(yī)學(xué)院湖北荊州434023
關(guān)鍵詞:花青素胰島試劑盒

涂獻玉 (長江大學(xué)醫(yī)學(xué)院,湖北 荊州 434023)

雷鴻斌 (長江大學(xué)附屬第一醫(yī)院 荊州市第一人民醫(yī)院檢驗科,湖北 荊州 434000)

鄭鵬才,王文英,張道明,張燕翔 (長江大學(xué)醫(yī)學(xué)院,湖北 荊州 434023)

龔 悌 (荊州市第二人民醫(yī)院病理科,湖北 荊州 434000)

低聚原花青素對1型糖尿病小鼠血脂代謝和胰島功能的影響

涂獻玉 (長江大學(xué)醫(yī)學(xué)院,湖北 荊州 434023)

雷鴻斌 (長江大學(xué)附屬第一醫(yī)院 荊州市第一人民醫(yī)院檢驗科,湖北 荊州 434000)

鄭鵬才,王文英,張道明,張燕翔 (長江大學(xué)醫(yī)學(xué)院,湖北 荊州 434023)

龔 悌 (荊州市第二人民醫(yī)院病理科,湖北 荊州 434000)

目的: 探討低聚原花青素(OPC)對1型糖尿病 (T1DM) 小鼠血脂代謝和胰島功能的影響及意義。方法:用鏈脲佐菌素(STZ)小量多次腹腔注射制作T1DM小鼠模型;實驗組分3個劑量每天灌胃OPC液,模型對照組和正常對照組則灌胃等容積蒸餾水。4周末酶法檢測動物血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量;免疫組織化學(xué)法檢查胰腺組織胰島中胰島素蛋白的表達。結(jié)果:與模型對照組比較,OPC給藥組癥狀改善;血清TC、TG和LDL-C明顯降低(Plt;0.05,Plt;0.01);HDL-C有所增加,但不具統(tǒng)計學(xué)差異(Pgt;0.05)。胰腺組織免疫組化染色結(jié)果顯示:模型組胰島中有多量淋巴細胞浸潤,僅少量殘留的胰島細胞被染成棕色,胰島素表達明顯減少; OPC組胰島中著色的胰島細胞明顯增多,胰島素表達明顯增加,淋巴細胞浸潤明顯減少。結(jié)論: OPC能夠降低糖尿病小鼠的血脂含量,提高胰島分泌功能,減輕由STZ誘導(dǎo)的自身免疫反應(yīng),有利于改善糖尿病癥狀和減少糖尿病心血管并發(fā)癥的發(fā)生。

低聚原花青素;1型糖尿病;血脂;胰島素

心血管并發(fā)癥是糖尿病(diabetes mellitus,DM)的主要并發(fā)癥和致死原因,而脂代謝異常是糖尿病患者發(fā)生心血管并發(fā)癥的重要危險因素[1]。天然抗氧化劑低聚原花青素(oligome-ric proantho-cyanidin,OPC) 由于具有降血糖、降血脂及免疫調(diào)節(jié)等作用和高效、低毒、高生物利用率等特點而受到醫(yī)藥界的廣泛重視[2,3],本文研究OPC對1型糖尿病(Type1 diabetes mellitus,T1DM)小鼠血脂代謝以及胰島素表達水平的影響,為OPC藥物開發(fā)和應(yīng)用于糖尿病及其并發(fā)癥的防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑與儀器 OPC:由葡萄籽和松樹皮經(jīng)紅酒萃取,美國Greensboro公司產(chǎn)品;鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ):美國Sigma公司;ACCU-CHEK Active型血糖儀及血糖測試條:德國ROCHE診斷有限公司;MODULAR PP全自動生化分析儀及酶法檢測配套試劑盒,包括總膽固醇(TC)檢測試劑盒(CHOD-PAP法)、甘油三酯(TG)檢測試劑盒(GPO-PAP法)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)及低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)檢測試劑盒(酶直接法):德國Roche公司;兔抗小鼠胰島素多克隆抗體(anti-Insulin)、過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素(Streptavidin Peroxidase,SP)試劑盒:北京博奧森生物技術(shù)有限公司;組織切片機、顯微照相裝置:德國萊卡公司。

1.1.2動物 健康雄性昆明小鼠60只,體質(zhì)量26~30g,由長江大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。

1.2方法

1.2.1糖尿病模型制作[4,5]用pH4.4的0.1mol/L枸櫞酸鈉緩沖液新鮮配制STZ溶液,按45mg/kg每日給50只小鼠行腹腔注射,連續(xù)5d。注射后小鼠自由飲水、進食標(biāo)準(zhǔn)飼料;每周1次采尾靜脈血測定小鼠全血血糖值,空腹血糖值在12mmol/L以上的小鼠為糖尿病模型。

1.2.2動物分組與OPC給藥 STZ末次注射后2周,取40只糖尿病小鼠分為4組,每組10只,每天上午禁食2h后灌胃給藥:①OPC低劑量組:OPC粉劑溶于蒸餾水按50mg/kg體質(zhì)量給藥;②OPC中劑量組:OPC 100mg/kg體質(zhì)量;③OPC高劑量組:OPC 150mg/kg體質(zhì)量;④糖尿病模型對照組和作為⑤組的正常對照小鼠(10只)灌胃等容量蒸餾水。

1.2.3主要觀測指標(biāo) 試驗過程中注意觀察動物飲水量、進食量、尿量和體質(zhì)量的變化及糖尿病癥狀表現(xiàn);4周末小鼠空腹摘眼球取血,3 000rmp/min離心分離血清,按試劑盒要求操作,檢測血清TC、TG、HDL-C、LDL-C含量;處死小鼠取胰腺標(biāo)本,4%多聚甲醛固定、石蠟包埋切片、脫蠟水化、微波抗原修復(fù)后,按SP試劑盒要求進行免疫組織化學(xué)染色(抗小鼠胰島素抗體工作濃度為1∶300)、DAB顯色、蘇木素復(fù)染、脫水、透明,中性樹脂封片,最后顯微鏡觀察、拍照。

2 結(jié) 果

2.1OPC對DM小鼠癥狀的影響試驗過程中觀察到T1DM模型組多飲、多食、多尿、體質(zhì)量減輕等糖尿病癥狀典型并在試驗過程中加重,而OPC各組以上癥狀明顯較輕且體質(zhì)量仍有緩慢增加,表明OPC具有緩解和改善糖尿病癥狀的作用。

2.2OPC對實驗動物血脂的影響糖尿病模型組表現(xiàn)為高血脂癥,與正常組相比,血清TC、TG、LDL-C顯著增高(Plt; 0.01,Plt;0.05),HDL-C降低但不具統(tǒng)計學(xué)差異(Pgt;0.05);與DM組比,OPC組血清TC、TG、LDL-C降低(Plt; 0.01,Plt;0.05),表明OPC主要降低TC、TG、LDL-C,并以中、高劑量作用較大,但對HDL-C的影響不明顯,見表1。

表1 OPC對糖尿病小鼠血脂含量的影響 mmol/L

注:與正常對照組比較,*Plt;0.05,**Plt;0.01;與模型對照組比較,△Plt;0.01,△△Plt;0.01。

2.3胰腺免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯微鏡下可見正常小鼠胰腺組織胰島數(shù)目多,呈圓形或橢圓型,結(jié)構(gòu)完整;T1DM組胰島數(shù)目明顯減少,形態(tài)結(jié)構(gòu)改變甚至被破壞, 有不同程度的淋巴細胞浸潤。(第89頁彩色圖版Ⅰ之)圖1示正常對照組胰島結(jié)構(gòu)完整,胰島細胞呈深棕色,著色部位在胞漿,胰島素高表達;(第89頁彩色圖版Ⅰ之)圖2示模型組胰島結(jié)構(gòu)破壞,多量淋巴細胞浸潤,僅少量胰島細胞著色,胰島素表達明顯減少;(第89頁彩色圖版Ⅰ之)圖3示OPC組,胰島結(jié)構(gòu)相對完整,胰島細胞著色淺但著色細胞明顯多見,淋巴細胞浸潤較少,表明由STZ誘導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)有所減輕,胰島素分泌增加。

圖1 正常對照組胰島素表達結(jié)果(×400) 圖2 模型組胰島素表達結(jié)果(×400) 圖3 OPC組胰島素表達結(jié)果(×400)

3 討 論

STZ小劑量多次注射STZ選擇性破壞動物胰島細胞, 使之釋放自身抗原成分刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生自身抗體,胰島B細胞進行性損害,胰島素合成受阻、缺乏, 導(dǎo)致自身免疫性1型糖尿病的發(fā)生。而胰島素不足,脂肪組織攝取葡萄糖及從血中移出甘油三酯減少,脂肪合成減少;脂蛋白酯酶活性低下,血游離脂肪酸和甘油三酯濃度升高則引起糖尿病的脂代謝紊亂[6]。本試驗表明,糖尿病小鼠脂代謝明顯異常,TC、TG和LDL-C顯著升高,HDL-C也有降低;OPC早期用藥能顯著降低糖尿病小鼠血中甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇,改善糖尿病小鼠的脂代謝異常。其作用機理可能是通過對糖尿病小鼠胰島β細胞的修復(fù)作用,促進胰島素分泌功能,從而起到減輕小劑量多次注射STZ所誘導(dǎo)的胰島自身免疫反應(yīng)、調(diào)節(jié)脂代謝和改善癥狀的作用。由于脂代謝紊亂是糖尿病腎病和心血管病等并發(fā)癥的高危因素,糾正糖脂代謝紊亂是減少和治療糖尿病并發(fā)癥的關(guān)鍵[1],因此OPC的以上作用在減少糖尿病并發(fā)癥,尤其是心血管并發(fā)癥方面可能具有重要意義。OPC目前主要用于保健品,但其作為降糖[7]、降脂及免疫調(diào)節(jié)的抗氧化藥物用途方面的研究應(yīng)用正在引起關(guān)注。鑒于我國的OPC資源豐富,而糖尿病及并發(fā)癥發(fā)生率高,我們的研究對OPC的進一步開發(fā)和應(yīng)用于防治糖尿病及其并發(fā)癥方面具有積極作用。

[1]錢榮立.糖尿病與血脂異常[J].中國糖尿病雜志,2002,10(2):125-126.

[2]張桂君,陸明海.一種有廣泛生物活性的黃酮——寡聚原花青素(OPC)[J]. 中國醫(yī)藥技術(shù)與市場,2006,6(2):42-44.

[3]高羽,董志.原花青素的藥理學(xué)研究現(xiàn)狀[J].中國中藥雜志,2009,34(6):651-655.

[4]丁學(xué)屏. 中西醫(yī)結(jié)合糖尿病學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2004:472-473.

[5]Emanuela A, Eleonora P, Roberto G,etal.Expression of Reg and cytokeratin 20 during ductal cell differentiation and proliferation in a mouse model of autoimmune diabetes[J]. European Journal of Endocrinology,1999,141:644-652.

[6]葉任高.內(nèi)科學(xué)[M]. 第5版. 北京:人民衛(wèi)生出版社,2001:798-805.

[7]涂獻玉,王文英,鄧德明,等. 低聚原花青素對STZ糖尿病小鼠血糖水平的影響[J]. 長江大學(xué)學(xué)報(自科版)醫(yī)學(xué)卷,2006,3(4):247-249.

[編輯] 一 凡

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2009.04.001

R587.1

A

16731409(2009)04R00102

20091111

湖北省科技廳計劃項目(2006AA402CO2 )

涂獻玉(1955),女,湖北省荊州人,副主任檢驗師,碩士,從事醫(yī)學(xué)免疫學(xué)教學(xué)與研究工作。

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